外泌体差速离心分离流程中的低温高速离心机配置要求

       目前全球广泛使用的外泌体超速离心(differential centrifugation, DC)分离法基础操作流程，源于法国居里研究所G. Raposo、A. Clayton等2006 年发表的《Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids》。文中详细描述了从细胞培养上清液和生物体液中分离外泌体的 基础操作流程1（参考《外泌体超速离心分离法基础操作流程1 (译稿)》）。
        基础操作流程1给出的超速离心全过程主要分为三个步骤：

步骤1：连续4℃低速(300×g，10分钟)、中速(2000×g，20分钟)离心，依次除去活细胞、死细胞碎片及样品中的其它有形细小颗粒；

步骤2：4℃下10000×g离心去除体积较大的微囊泡及凋亡小体;

步骤3：4℃下100000×g离心沉淀外泌体组分并除去与之共沉淀的蛋白质等杂质。

       实际应用中，因初始提取样品材料类型、体积不同，加之不同实验条件不一，样品的高速离心处理环节，具体细节往往存在差异。在此，我们对基础流程1中超速分离前的低温离心流程综合考虑，对其中所需的离心机性能和转头配置要求加以探讨。

       ISEV调查结果显示，分离EVs所用初始样品中，血浆体积通常在5mL以内，尿液为5-100mL，有25%受访者实验所用细胞培养基>100mL，所用培养基体积5-100mL的实验近50%，脑脊液和牛奶起始体积5-100mL，来自复杂基质样品、非哺乳动物来源的样品体积少于1mL。

       对起始材料离心，既要保证效率又要避免材料在离心容器中的损失和污染，则低温离心机配置应满足以下要求。

1. 单管容量

       单管容量应覆盖1.5mL – 100mL范围，以1.5mL – 250mL范围最佳。其中应包括1.5mL、10mL圆底管、15mL尖底管、50mL尖底管、100mL圆底管、200mL尖底管和250平底离心管/瓶配套适配器和（或）辅助垫片附件。

2. 转头配置

       10 - 250mL容量离心管/瓶用于2000×g以下低速离心沉淀细胞和微小颗粒；

       1.5– 50mL高速角转头用于10000×g-20000×g阶段大囊泡、凋亡小体的沉淀。

       考虑到尖底离心管、锥形离心瓶生成沉淀后转移上清操作的便利，高速角转头中可优先考虑能直接离心15mL/50mL尖底管的高速角转头，如Beckman JA-12尖底管角转头（12×50mL/12000rpm/23200×g)、Thermo F15-8×50cy（8×50mL锥形管/ 14500rpm/RCF 24446×g）、F13-14×50cy（14×50mL锥形管/10000rpm/RCF 17105×g）。其次是50-100圆底管高速角转头，如Thermo F15-6×100y转头(6×100mL/15000rpm/RCF 24652xg)、Highconic II角转头(6×94mL/10350rpm/RCF 15090×g，PN75003620)、eppendorf F-34-6-38角转头（6×85mL /11000rpm/RCF 15550×g）、Beckman JA-18(10×100mL /18000rpm/47900×g)、JA-25.50(8×50mL/25000rpm/75600×g）和S-13.1高速水平转头（6×50mL/13000rpm/RCF26500×g）。

       须注意：外泌体分离流程中所需的RCF值应理解为转头平均半径处RCF_av，而非产品资料中标示的该转头在最高转速下产生的最大RCF_max。因此，凡转头标示最大RCF为10000 - 12000×g角转头、水平转头，如其RCF_av根本无法达到10000×g离心要求。

       以图中Beckman S40410水平转头为例，额定最高转速10000rpm时，转头最大离心力为10733×g，但此时转头内部的平均离心力仅为6826×g。Thermo HighConic III 锥形管角转头（最高转速9500rpm/RCFmax 12108×g）、Allegra X-30R使用F0685定角转头(6×85mL/最高10000rpm/RCFmax 10864×g)都存在相同现象。

3. 离心机机型

       既满足300×g - 2000×g离心，又能适应10000×g高速沉降要求的低温离心机，可首选相对经济的中等容量台式低温高速离心机，如Thermo Multifuge X1R Pro、Sorvall ST1R Plus、eppendorf 5804R等。

       实验条件许可， Beckman Avanti J-E、Avanti J-26 XP、Avanti JXN-26和Avanti JXN-30及Himac CR -22N等立式低温高速离心机亦无不妥。如3.1.1.4 培养细胞外泌体结构与质谱分析项目中，用到Beckman Avanti J-J26XP立式低温高速离心机JA 25.15高速角转头（25000rpm/24×15mL)对去除细胞碎片后的上清12500×g、40 min、4℃离心去除体积较大的mEVs、lEVs后再进行超速沉降外泌体。