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拨开云雾见月明——英捷iBright FL1500 Western荧光成像分析仪技术特点解析-4
iBright FL1500 蓝绿透射光源的检测应用
Western Blot荧光成像分析仪的江湖上，伯乐ChemiDoc MP、GE Amersham ImageQuant 800 Fluor（AI800 Fluor）、耶拿UVP ChemStudio Plus和赛默飞Invitrogen iBright FL1500这四雄，要论硬件配置上最显著的区别，恐怕是非透射光源（Transilluminator）莫属。因为，伯乐、UVP的系统用了经典302nm的透射紫外台（Trans-UV）；AI800 Fluor默认装备是LED透射白光（LED trans-white），当然可以选配AI800 UV升级模块；而iBright FL1500标配是一台LED蓝绿光透射仪（green-LED transilluminator）。
很明显，GE主打Western+蛋白凝胶图像分析，Bio-Rad和UVP是要兼顾核酸、蛋白凝胶成像需求，而Thermo Fisher则意图实现凝胶类等透明样品的激发、照明多样化检测。那iBright FL1500的这一设计究竟是锐意创新的结晶，还是哗众取宠的败笔？这一问题值得探讨。
一、透射蓝绿色光源在核酸凝胶检测中应用的表现
根据文献报道和厂商使用说明，对4大类核酸常用荧光染料标记凝胶成像激发方案汇总后，可获得表1所列信息。
表1 常见核酸荧光染料激发波长列表
样品类型 | Trans-green (490–520nm) | Trans-UV (280–320nm) | |
核酸凝胶 | Ethidium Bromide (EB) | ● (518 nm) | ●● (302 nm) |
GelRed | ● (488 nm) | ●● (302 nm) | |
GelSafe | ● (514 nm) | ●● (309 nm) | |
GelGreen | ●● (500 nm) | ● (302 nm) | |
SYBR Gold | ●● (495 nm) | ● (302 nm) | |
SYBR Safe (DNA) | ●● (502 nm) | ● (302 nm) | |
SYBR Green I (dsDNA) | ●● (497 nm) | ● (302 nm) | |
SYBR Green II (RNA) | ●● (497 nm) | ● (302 nm) | |
Goldview/AO (＞1 kb DNA) | ●● (491 nm) | ●● (294 nm) | |
科研实验中不少荧光试剂，在紫外、蓝光波长下都有强度不等的吸收峰。理论上，可使用其中任何一种光源激发。
以溴化乙锭（EB）为例，它的激发峰有两个：波长300 nm最大激发峰（主激发峰）和波长518nm次激发峰，次激发峰强度明显低于紫外波长激发峰。蓝绿光透射仪虽然可以有效激发EB，而且经1.25kb基因扩增产物琼脂糖凝胶成像对比证明，用302nm紫外光透射仪激发和基于iBright FL1500 Western成像分析仪检测，所获凝胶图像效果极其接近。
厂商发布的荧光染料技术资料中推荐的激发波长，素有主激发峰波长、可用激发波长(次激发波长)之分。在主、次激发波长的条件下，荧光基团发光强度有差异，使得相同曝光时间内，凝胶的中、低丰度样品条带的图像信号表现可能不一致。若成像条件未经优化，为强化弱信号条带检测而延长曝光时间，不仅会引入更多图像背景噪音成份，还可能造成强信号条带过饱和，高中低信号条带强度对比失真。而基于过度曝光的图像信号定量条带样品含量，不符合ImageJ指南关于图像分析中运用朗伯-比尔定律的条件。
一般情况下，采用荧光试剂最大激发峰波长检测，具有更好信噪比，有助于提高检测灵敏度。因此，样品丰度的定量分析应基于染料的主激发波长测定，而定性分析（如样品分子量对比鉴定）可以采用次激发波长检测。
整体上，波长490-520 nm蓝绿光透射仪与凝胶成像分析仪标配302nm透射仪（波长范围280–320nm，辐射能量峰波长302nm），二者可激发的荧光染料种类基本重叠。
对两种文献报道中常用的核酸相对定量分析染料SYBR Gold、SYBR Green的激发效果，蓝绿色激发光显然更优。而302nm紫外则最适于溴化乙锭EB、GelRed 和GelSafe的检测。
Gel Safe类核酸安全无毒染料，虽兼容蓝光、紫外两种激发波长，但基因克隆实验中，蓝绿光照射可避免凝胶观察和切胶过程中，人体和样品的紫外线暴露损伤风险。故GelRed、GelSafe等染料在实际使用中，更多的是基于蓝绿光而非紫外线来检测。何况，LED光源使用寿命比紫外灯长，无须定期更换，节省管理维护成本。
因此，核酸凝胶检测应用，iBright FL1500的490-520nm波长透射仪配置方案要优于常规紫外透射仪。
二、蓝绿色透射仪在蛋白检测中的应用
生物医学实验中蛋白样品类型多样，手工和预制SDS-PAGE凝胶，常规免染型凝胶和基因克隆平板都是常用样品。
蛋白免染凝胶荧光的应用，iBright FL1500荧光成像仪不支持伯乐的蛋白免染凝胶检测，只能使用英捷免染荧光试剂。这一点在《英捷iBright FL1500 Western荧光成像分析仪技术特点解析-2》已有讨论。
有文献报道了用iBright FL1500 的LED蓝绿光透射仪从底部照射搭载有GFP基因的克隆培养板，对靶蛋白表达克隆进行快速筛查和克隆荧光计数分析。
表2 透射蓝光与302nm紫外激发的蛋白凝胶荧光染料对比表
样品类型 | Trans-green (490–520nm) | Trans-UV (280–320nm) | |
蛋白凝胶 | SYPRO Ruby (总蛋白) | ● (460 nm) | ●● (280 nm) |
SYPRO Red (总蛋白) | ●● (520 nm) | ● (300 nm) | |
SYPRO Tangerine (总蛋白-WB) | ●● (490 nm) | ●● (300 nm) | |
Oriole (总蛋白) | ●● (302 nm) | ||
Flamingo火烈鸟(总蛋白) | ●● (490-520 nm) | ||
Pierce Krypton (总蛋白) | ●● (520 nm) | ||
Pro-Q Diamond (磷酸化蛋白) | ●● (520 nm) | ||
Pro-Q Emerald 300 (糖基化蛋白) | ●● (302 nm) | ||
Pro-Q Emerald 488 (糖基化蛋白) | ●● (510 nm) | ||
InVision His-tag (His标签蛋白) | ●● (LED白光板替代) | ●● (302 nm) | |
免染荧光应用 | 支持总蛋白定量分析 | ●● (英捷no-stain试剂) | ●● (伯乐Stain-free胶) |
菌落平板 | GFP表达克隆筛查 | ●● (490 nm) | |
表2数据显示：蛋白凝胶荧光检测应用，490-520nm蓝绿光和302nm透射仪的适用性各有千秋。用于凝胶总蛋白、翻译后修饰蛋白的定量分析的常用荧光染料检测的支持方面，两种透射光源都存在短板，难以有效覆盖全部应用。相对而言，透射蓝绿光源的兼容性更好。
这给了我们一个有益的启示：在考虑蛋白凝胶成像分析系统配置中，如有可能，应将紫外、蓝光两种透射光源相结合，可极大提升系统蛋白凝胶检测应用的灵活性。
iBright FL1500只能装配蓝绿透射仪，无紫透射外台可供升级。而ChemiDoc MP、UVP ChemStudio Plus可以在标配基础上加配蓝光屏或LED透射蓝光台（trans-blue）,通过搭配，两种检测光源取长补短，相得益彰，实现检测功能扩展的自由。
三、小结
作为一款主要定位于Western blot实验印迹荧光、化学发光ECL检测的高端成像分析仪， Invitrogen iBright FL1500通过引入蓝绿透射光源和白光板这套配置，实现了对核酸凝胶、蛋白凝胶的荧光、可见光检测分析的有效兼顾，从技术层面来说无疑非常成功。
正所谓尺有所短寸有所长，iBright FL1500不可能是完美无缺的杰作。
首先，在核酸凝胶检测上，由于官方只证实蓝绿透射仪可以有效支持EB标记染料的成像分析，但缺少EB染料标记核酸定量检测动态线性范围，以及这一线性范围与基于标准302nm波长检测条件下动态范围的对比数据。当用于高浓度的核酸样品（如PCR扩增产物）、低丰度样品（低表达mRNA）和稀有珍贵样品的定量分析时，若无相应验证过程，则数据可靠性难免存疑。
其次，在蛋白凝胶检测上，iBright FL1500蓝光透射仪可支持总蛋白检测、修饰后蛋白检测，但依然存在对Oriole (总蛋白检测) 、Pro-Q Emerald 300 (糖基化蛋白检测)等染料不兼容的问题。
此外，不支持已广泛应用的伯乐免染凝胶荧光的检测。
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