从PubMed数据看Beckman超速离心机Type 19角转头的配置与应用

       最高转速13000-16000rpm、工作容量6×250 mL的高速角转头，如Beckman avanti系列立式高速离心机所用的JLA16.250和JA-14，Himac CR22N配属的R13A等，常见于生物工程类实验中培养菌体的离心收集。

       Type 19转头额定容量6×250mL，是含Optima XPN、Optima XE系列在内的Beckman立式超速离心机转头中容量最大的角转头，最高转速19000rpm，转头内部RCF_max、RCF_av和RCF_min分别为53900×g、32100×g和13800 ×g（RCF的含义及计算方法可参考《Optima MAX-XP超速离心机转头的选择对外泌体分离效果影响的分析》）。从转速和RCF值看，它与JA-30.50（3000rpm；R_max 108860×g）、JA-25.50（25000rpm；R_max 75600×g）等同属于高速离心机转头。但转头内部RCF强度分布极不均匀，RCF值跨度达14000 - 54000 ×g。转头K因子值951，远高于JA-30.50（k因子值280）、JA-25.50（k因子值481）和JA-18（k因子值566）。可见，Type 19对纳米尺度的样品颗粒、囊泡和大分子组分的分离效率不高。那它在科研实验中的主要应用对象是什么，实际使用率如何？

       截止至2023年9月30日，合并以“Beckman[Text Word] AND Type-19[Text Word] AND rotor[Text Word]”、Beckman[Text Word] AND Type19[Text Word] AND rotor[Text Word]检索词的查询结果，在PubMed期刊数据库中共检索到文献记录118+5条。逐一核实并剔除检索词设置所致误差后，实得有效实验应用文献103篇，刊文时间为1968年11月至2023年8月（见图1）。

       从图上看，Type 19转头运用有1694-1968、2000-2005两个低谷和1976-1981、2018-2023两个小高潮。第二轮高潮始于2006年持续时间长，目前仍处于上升阶段。

1、Type 19角转头在病毒类实验中的应用

       将人类和脊椎动物宿主病毒、慢病毒等病毒样颗粒(Virus-like particle, VLPS)、疫苗生产用病毒工程载体及植物病毒、藻类病毒、细菌病毒合并为病毒类样品后，在103个研究应用实例中，病毒类研究对象为86例（占比83.4%）。其中包括动物病毒（如免疫缺陷病毒1型、EB病毒、流感病毒、轮状病毒、麻疹病毒、单纯疱疹病毒、登革热病毒、基孔肯雅病毒Chikungunya Virus、卡波西肉瘤相关疱疹病毒KSHV、黄病毒、狂犬病病毒等23个病毒科属）、噬菌体、植物病毒和小球藻病毒1型。研究方向涵盖病毒感染致病机制、诊断检测、基因分型、功能蛋白的组装机制、特效药物研究和病毒疫苗开发6个方面。

1.1病毒疫苗生产流程中的应用

       以流感疫苗扩增工艺为例。将高产流感病毒骨架搭载病毒HA和NA vRNA片段后克隆到pHH21载体中并转染293T细胞，收集细胞培养液上清，接种到10日龄胚胎鸡蛋中孵育48小时。采集尿囊腔中尿囊液（allantoic fluids），经4℃下3500rpm离心30分钟澄清尿囊液，再以Tyep 19角转头18500 rpm4℃离心2小时。收集沉淀并重悬于5mL PBS中，用相同转头、离心条件经线性蔗糖密度梯度（20%-30%-35%-40%-45%和50%）纯化后，收集病毒条带用PBS稀释，进一步以SW32 Ti水平转头4℃下25000rpm离心2小时除去蔗糖溶液采集病毒沉淀用于后续灭活处理。

1.2 病毒感染机制研究的应用

       基孔肯雅热病毒（Chikungunya virus，CHIKV）是一种由蚊虫叮咬传播的有包膜的单股正链RNA病毒。CHIKV主要通过网格蛋白介导的内吞作用（(endocytosis)）进入宿主细胞，被吞噬到内体(endosomes)中。内体的低pH环境触发病毒表面蛋白构象变化，包膜和内体膜发融合形成融合孔，病毒核衣壳藉此通道进入胞质，并被分解以释放病毒RNA并启动复制。用冷冻电镜断层成像技术(cryo-electron tomography, cryo-ET)和子断层图像平均技术（sub-tomogram average, STA）结合的方法，可在接近天然的条件下对病毒粒子结构变化、糖蛋白构象以及膜融合过程进行捕获和观察。

CHIKV病毒S27毒株的制备和纯化过程是：BHK-21细胞在补充有10% FBS的DMEM培养基中以37℃培养，在细胞病毒感染复数（multiplicity of infection, MOI）为4.0时染毒处理1.5小时。继续培养25-27小时后收集培养基，用type 19角转头4℃下53791×g离心2小时将沉淀病毒，随后在HNE缓冲液中重悬，在蔗糖密度梯度液中用SW 41Ti水平转头4℃下68405xg离心过夜，提取纯化的病毒条带。

1.3 病毒致病机制研究应用

       卡波西肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus, KSHV)基因组中K15编码的KSHV非结构膜蛋白招募并激活几种细胞蛋白，包括磷脂酶Cγ1（PLCγ1），NF-κB途径的组分以及SRC家族的非受体酪氨酸激酶(Non-receptor tyrosine kinase，NRTK)成员，在炎症信号途径激活中发挥重要作用。为鉴定参与pK15炎症激活途径的细胞成分，从KSHV感染的内皮细胞中免疫沉淀pK15，并通过无标记定量质谱鉴定了相关蛋白质。研究发现：II类磷脂酰肌醇3激酶（PI3K-C2α）参与活化受体酪氨酸激酶的内吞作用及胞内细胞器的信号传导，与核周区域富集囊泡结构中的pK15发生共定位。分析表明，PI3K-C2α有助于PLCγ1和Erk1/2的pK15依赖性磷酸化，并在 KSHV 裂解复制中发挥作用。

重组病毒rKSHV.219的制备方法为：在 2.5μg/ml 抗人 IgM 抗体存在下，BJAB-rKSHV.219细胞在转瓶中培养4-5天后收集细胞培养物，先低速离心去除培养基中细胞和碎片，将上清0.45μm过滤器过滤后，滤液在Type 19角转头中4℃下15000rpm离心5小时。收集病毒沉淀，重悬于EBM-2MV培养基中作为HEK-293细胞病毒感染源。

1.4 慢病毒载体介导的基因敲除应用

       MYC、BMI1和BCL-XL（MBX）是已知的与细胞分化、增殖和凋亡调控有关的功能基因。p53是干细胞基因组质量监控分子，可在转录水平上抑制MBX等调控网络关键基因的表达，使多能干细胞（Pluripotent stem cells，PSCs）快速启动分化和凋亡。

       细胞周期蛋白依赖性激酶2 (cyclin-dependent kinase 2，CDK2)和CDK4主要作用于细胞周期的G1期和S期。活化的cyclin与CDK组成的蛋白激酶复合物，促使细胞通过G1/S检验点进入S期，启动DNA复制，诱发有丝分裂，驱动细胞分裂增殖。而CDK抑制剂（CDKIs）则可抑制cyclin--CDK复合物的活性。

       科研人员通过强力霉素（Dox）诱导MYC、BMI1和MBX表达手段已建立了人多能干细胞（hPSC）衍生的巨核细胞祖细胞（imMKCLs）体系以应对血小板制品短缺问题。但imMKCLs存在增殖潜能低的问题。而MKCL细胞基因表达谱分析发现，CDKIs的过表达与MKCL增殖潜能呈负相关。通过诱导MYC/BMI1/BCL-XL调控基因的过表达并沉默CDKN1A和p53，可稳定诱导imMKCLs产生血小板。

针对CDKN1A和p53的基因沉默用的是携带有靶基因shRNA序列慢病毒载体转染的方法。

       为提取保存于HEK293T细胞中shCDKN2A-GFP和shp53-GFP慢病毒载体，使用Optima L-100 XP超离心机Type 19角转头4℃下19000rpm离心4.5h沉淀病毒载体后用于下一步基因敲除操作。

1.5 病毒类样品分离基础操作步骤

       无论是病毒基因组结构分析、蛋白结构及组装、抗原特征分析或慢病毒介导的基因敲除应用，都离不开病毒/病毒载体的分离纯化。

       以培养细胞作为初始源材料的病毒样品的分离流程，通常包括以下两个基本操作：

1）将染毒细胞培养基收集，4℃低速离心去除细胞及细胞碎片，澄清上清；

2）上清用Type 19转头高速沉淀病毒颗粒。

       86个病毒类研实例中离心转速/RCF及离心时间信息可查的有效记录78例。

       含病毒颗粒的细胞培养上清液的高速沉淀操作环节，Type 19转头转速设定为15000rpm-19000 rpm有62例（RCF_av 21000 - 33000×g）。另有14例报道中，沉淀病毒所用转速介于8000-14100 rpm（RCF_av相当于6200 - 18700×g）。

       对比Beckman Type 19、Avanti系列立式高速离心机配属的高效角转头JLA16.250、JA-14的工作性能参数（见表2）可知，当Type 19转头的工作转速降低至14000rpm时，转头内部RCF强度、分离效能（参考K因子值）已跌至JA-14转头水准，低于JLA16.250转头离心性能。

表1.  Beckman Type 19角转头不同工作转速下转头RCF值分布表

表2. Beckman Type 19与Avanti系列 高效角转头间工作性能参数对比表

       病毒沉时间方面，有49例设定的离心时间为2-6小时（占比超过60%）。而离心时间≤1.5小时或≥8小时的总数为29例。

2、Beckman超速离心机Type 19角转头在非病毒类实验研究中应用

       Type 19角转头在非病毒类实验应用仅16例，涉及解脲支原体、胞体、细胞器、细胞外囊泡、蛋白和受体等的分离。

2.1 胎盘滋养层细胞膜的制备

       胎盘粗膜制备流程基于1982年Pearse B. M报道的方法修改而来：采集新鲜的足月分娩产妇胎盘，去除浅膜、血管和脐带后切成碎末，在冰冷 Tris-HCl 缓冲液中冲洗去除血污后，在添加蛋白酶抑制剂的2倍体积囊泡缓冲液(0.15M NaCl, 1 mM EGTA, 0.5 mM MgCl2, 0.02% NaN3, and 0.2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride)中，用Waring搅拌机以最高速度匀浆1分钟，用JA-10角转头4℃下5000rpm离心30分钟弃沉淀，上清添加10U /mL胰RNA酶、室温下孵育30分钟，在Type 19角转头中4℃19000rpm离心3小时，制备粗膜沉淀（注：原方法为4℃下RCF 55000×g离心1小时。而Type 19最大RCF仅53900×g）。

2.2 以牛主动脉制备微粒体(Microsomes)

       12-15条主动脉(aortae)在3L咪唑(imidazole)匀浆缓冲液（0.3 M蔗糖，5mM咪唑盐酸盐，pH 7.4）中室温解冻后，将平滑肌层分离，用绞肉机绞碎。取1250g碎末在250 mL咪唑匀浆液中用Waring搅拌机以最大速度匀浆90秒。匀浆液用JA-10转头8000 rpm离心20分钟，收集上清同时收集沉淀。将沉淀重悬于含1mM MgATP的250mL咪唑匀浆液中，重复一次均质和离心操作。将前后两次匀浆液离心所得上清通过四层粗棉布过滤，用type 19转头19000 rpm离心2小时或在JA-14转头中14000 rpm离心3小时。收集沉淀，在300mL 0.3M蔗糖/20mM焦磷酸钠/20mM磷酸二氢钠/imMMgCl2/0.5mMEDTA（pH 7.1）中重悬，经第三次均质、离心，收集并过滤上清液后，用type 19转头19000 rpm离心2小时，收集的富含微粒体的沉淀组分备用。

2.3 解脲支原体16S rRNA基因提取分离

       从broth cultures培养基中将处于对数生长期的解脲原体（Ureaplasma）收集，胞体用SDS裂解、RNase酶和蛋白酶K处理，用苯酚、苯酚-氯仿和氯仿提取分离DNA。添加乙酸钠和乙醇后用L5-50超速离心机Type 19转头20000×g离心25分钟沉淀，获得解脲支原体DNA。

2.4 植物蛋白酶抑制剂的提取

       收集受伤番茄叶子，用液氮速冻后冻干，在Waring均质机中研磨3分钟。将8.5 g叶片粉末与 170 mL提取缓冲液（0.1 M K-磷酸、0.3 M KCI 和 3 mm 焦亚硫酸钾，pH 6.5）混合，用磁力搅拌器轻轻搅拌 5 分钟后，用Type 19转头33456×g离心15分钟澄清，所得上清即蛋白酶抑制剂粗提物。

3、关于Beckman 超速离心机配置使用Type 19角转头的讨论

3.1 Type 19角转头的主要应用定位问题

       资料表明，Beckman立式超速离心机的Type 19角转头设计定位于大容量高速离心，在病毒学研究应用，特别是以培养菌体、细胞为初始样品材料的病毒类样品研究、病毒疫苗和治疗特效药物的开发方面应用，是科学合理的。采用Type 19转头将病毒颗粒从大体积（800mL-1600mL）样品中通过15000rpm以上高速离心的初步沉淀，再结合容量稍小的VTi 50.1垂直转头、NVT 65近垂直转头或水平转头SW 55 Ti、SW 41 Ti及SW 32 Ti等完成病毒密度梯度纯化，可实现工作流程的无缝衔接，十分便捷。此外，Type 19转头还可兼顾蓝藻、支原体和细菌等微生物颗粒的收获、组织细胞匀浆液的澄清和亚细胞组分的分离实验应用。正因为此，Type 19角转头从Spinco L系列超速离心机起，虽经历Model L2、L3、L4、L5、L7、L8 、Optima L-XP直至Optima XPN、Optima XE的更新换代，却历久弥新，沿用至今。随着基因治疗技术应用的拓展、AAV等工具载体技术改进和病毒性传染病防治研究的深入，这一经典转头的应用将会迎来新一轮高光时刻。

       Type 19转头为常规铝合金材质转头，满载情况下重达17公斤。在超速离心机上操作此般体量的转头，载样重量精细配平、转头安装精准就位与拆卸时轻拿轻放，无论对实验者或超离管理人员，其安全风险不容忽视。因此，预算条件受限时，Type 19转头通常不会作为优先配置的选项。

        尽管Type 19转头上市和应用已数十载，但迄今为止，在PubMed期刊文献报道中出现次数不过区区103次。其普及程度不仅远低于Type 90 Ti、Type 70 Ti、Type 45 Ti等Beckman立式超速离心机所属的同类角转头，被公开报道的使用频次甚至不及VTi 50、NVT 65等新型转头（见图5）。Type 19宛然成了超速离心转头中偏安于一隅的小众。

       与相同功能定位的JLA-16.250、JA-14比，在离心转速不高于14000rpm的应用环境下， Type 19转头毫无效能优势可言。

       2000.01-2.23.09期间JLA-16.250与Type 19在PubMed期刊刊文报道出现频次的分段统计（见图6）显示，近10余年，新型轻质J-LITE JLA-16.250转头（空重仅10.3公斤）有关的发文数量和报道的增长幅度，均已后来居上。

3.2 对Type 19转头工作条件设置的准确描述问题

       多年来，对离心机和转头的资料上倾向于强调转头的最高转速、最大RCF和最大工作容量指标，无意中忽视了转头的Rav、R_min及K因子值等性能参数。这一做法对实验者的消极影响有2方面。一是概念上的误解，二是转头工作参数设定的困扰。

       转头标示的最大相对离心力（注：RCF为最大离心加速度值或最大离心力场强，相对离心力为习惯法），是转头工作时产生的RCF理论极限值。在剔除离心管/瓶壁厚度、配套适配器壁厚度后，转头实际最大RCF值要小转头额定RCF值，且RCF_max只适用于离心管底部最外侧这一极小范围，除此之外管内任一位置样品所承受的实际RCF强度都不使用。样品管内大部分区域内样品所承受的RCF强度均小于RCF_max。与R_max位点越远，样品工作有效RCF越小。

       Beckman离心机控制系统是基于对转速精准控制计算出转头对应的RCF_av。Type 19以额定最高转速运行时，系统计算显示的RCF值33860×g为RCF_av而非RCF_max。事实上，该转头是无法按设定RCF=54000×g的要求来运行的，RCF值只能设定为不高于33900×g。但应用实例中，将Type 19转头工作RCF值报告为54000×g、53000×g、48500×g、35000×g的错误不在少数。

       只关注RCF_max而忽视影响转头分离效能的RCF_av、R_min这两个关键技术指标，容易误导实际工作中对转头转速或RCF设定。当Type 19转头以12000rpm转速运行时，转头RCF_max达到21000×g，但离心瓶内部RCF_av 大小约13500 ×g，RCF_min强度更是低至5540 ×g。此时，离心瓶内侧样品承受的RCF值介于5540 - 13500 ×g。10000×g以内RCF强度，通常被认为难以将病毒颗粒从培养基中有效、完整沉淀。而实验报告中Type 19转头RCF设定为100000×g或9846×g用于病毒沉淀，明显有误。

       美国卫生与公众服务部公共卫生服务疾病控制和预防中心Gwong-Jen J. Chang等对组织细胞培养基中VLPs离心操作参数是这样描述的：在Beckman Type 19转头中4℃下19000rpm离心过夜，从转染质粒pCB8SJ2的中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary, CHO）细胞培养基中浓缩分泌的抗原，并重悬于TNE缓冲液（50mM Tris，100mM NaCl，10mM EDTA，pH 7.5）至原始体积的1/200。据文中转头型号、工作转速和离心时间、离心温度信息，读者运用于同类实验离心工作条件设置和优化。此外，亦可标注主机型号、转头型号和RCF设定值替代转头型号及工作转速信息。

3.3 病毒类样品沉淀操作中Type 19替代转头选择问题

       当进行AAV或慢病毒载体和VLPS等病毒类样品沉淀分离、微粒体等亚细胞组分制备等对RCF有较高要求离心实验，而手头无Type 19转头可用时，基于Type 19转头RCF_av值34000×g、RCF_min值14000×g的特点，可有两种转头替代方案。

       首选是Avanti  J-E、Avanti J-26XP、Avanti J-XN 26和Avanti J-XN 30立式高速离心机JLA-16.250方案：转速16000rpm，并适度延长离心时间。

       其次是Type 45角转头方案：用94mL Quick-Seal Ultra-Clear或81mL thickwall超速离心管，转速28000rpm，每轮可完成900-1000mL样品浓缩处理。

       当Type 45、JLA-16.250两款转头都无法获取时，还可采用JA-18转头方案：采用100mL Ultra-Clear超速离心管或94mL离心瓶，转速18000rpm，参考原Type 19离心时间设定或适度缩短时间，每轮运行离心940-1000mL样品。

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