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赤橙黄绿青蓝紫 谁持彩练当空舞——激酶活性HTRF检测的荧光酶标仪方案-下
基于应用的多功能荧光酶标仪选型-3
（续：激酶活性HTRF检测的荧光酶标仪解决方案-中）
三、HTRF检测应用中多功能荧光酶标仪的选型要略
常规FI、TRF、FRET检测，人们可能只关注到荧光酶标仪的激发、发射波长配置与测试要求契合的问题。而当了解HTRF标准流程后，对优化荧光检测条件的意义和其中涉及的技术要素之复杂，兴许会有感悟。
开展HTRF测试前，实验者首先须确认是否有可利用的HTRF认证多功能荧光酶标仪资源。
表2 Cisbio HTRF认证部分品牌多功能荧光酶标仪列表
Manufacturer | BMG | PerkinElmer | MD | BioTek | Tecan |
可供型号 | VantaStar FluoStar Omega PolarStar Omega ClarioStar Plus PheraStar FSX | EnVision XCite EnVision HTS | SpectraMax iD5 SpectraMax Paradigm SpectraMax i3x SpectraMax M5e Flexstation 3 | Synergy H1 Synergy NEO2 Cytation 1 Cytation 5 | Infinite F Nano+ Infinite F Plex Spark |
停产型号 | Clariostar Pherastar Plus Pherastar FS | / | SpectraMax i3 | Cytation 3 Synergy 4 Synergy H4 Synergy NEO Synergy 2 | Infinite F200 PRO Infinite F500 Infinite M1000 Infinite M1000 PRO Safire 2 |
(资料来源：PerkinElmer&Cisbio官网信息，入选时有删减)
确认多功能荧光酶标仪属HTRF认证型号后，还应核实是否配置有HRTF检测规定的专用光学元件。不同品牌机型，制造商提供的HTRF功能组件有区别。
如VantaStar、Folarstar Omega、SpectraMax iD5、Synergy NEO2均须添加HTRF专用的具有Z轴调节功能的增强型时间分辨荧光模块（Enhanced TRF module）、320/340nm紫外激发滤片、520/620/665nm发射荧光滤镜这三件套。
相对而言，MD SpectraMax i3、SpectraMax Paradigm、SpectraMax i3x这三款荧光酶标仪，由于采用的是检测功能模块化设计，必要时直接将选配的HTRF检测卡盒插入主机卡槽就可以启动测试。实验者无须为激发与发射滤光片的波长与带宽、二向分色镜截止波长范围这类问题纠结。
为方便查询，表3列出了部分品牌制造商的HTRF认证机型系统配置，可供参考。
表3 品牌多功能荧光酶标仪HTRF检测所需配置
Brand | Instrument Model | HTRF Configurations |
MD | SpectraMax iD5 | HTRF Detection System (6590-0144), includes: Enhanced TRF module (0200-7030) Filter slides EX: 340nm BW 70nm (6590-0080) EM2: 520nm BW 15nm (6590-0098) EM1: 616nm BW 10nm (6590-0118) EM2: 665nm BW 10nm (6590-0121) |
SpectraMax Paradigm | Cisbio HTRF detection (0200-7011) , includes: Xenon light source 616nm EM1 filter 665nm EM2 filter | |
SpectraMax i3X | ||
BioTek | Synergy H1/H4 | HTRF europium/Red filter cubes (8040505): EX 330/80nm; EM1 620/10nm, EM2 665/8nm; Dichroic 365nm |
Synergy Cytation 1/3/5 | ||
Synergy NEO2 | 1) HTRF Europium/Red Kit, includes: HTRF-europium Excitation cubes(1035011): 330/80nm; Dichroic 365nm HTRF/Lance red Emission cubes (dual emission)(1035041): EM1 620/10nm, EM2 665/8nm; Dichroic 650nm 2) HTRF Europium/Green Kit, includes: HTRF terbium Excitation (1035012): 340/30nm; Dichroic 400nm HTRF green Emission cubes (dual emission)(1035049): EM1 520/10nm, EM2 620/10nm; Dichroic 550nm | |
BMG | VantaStar | 1) HTRF Europium/Red Kit, includes: Advanced Optic Head with z-adjustment for TRF/TR-FRET Excitation filter：337nm (TR-Ex H)(001-337TR) Emission filter：620/8.5nm(001-615TR); 665/10nm(001-665TR) 2) HTRF Terbium/Green Kit, includes: Advanced Optic Head with z-adjustment for TRF/TR-FRET Excitation filter：337nm (TR-Ex H)(001-337TR) Emission filter：620/8.5nm(001-615TR); 520/10nm(001-520TR) |
Tecan | Infinite F Nano+ | 1) HTRF Europium/Red Kit, includes: Excitation filter：320/25nm (8C138) Emission filter：620/10nm;Dichroic 510nm(6F041) 2) HTRF Terbium/Green Kit, includes: Excitation filter：320/25nm (8C138) Emission filter：665/8.5nm;Dichroic 510nm(9E336) |
nfinite F Plex | ||
Spark | ||
PE | EnVision XCite (TSM) | 1) HTRF Europium/Red Kit, includes: Excitation filter：UV2(TRF) 320 (#111) Emission filter：APC 665 (#205) 2nd emission filter：CY5 620 (#118) or 615 (#203) Top Mirror：TRF advanced single mirror (#615) or Lance/Delfia D400 single mirror (#412) 2) HTRF Terbium/Green Kit, includes: Excitation filter：TRF UV2 340 (#101) Emission filter：TRF 520(#275) or (#226) 2nd emission filter：495 (#276) for simultaneous readout Top Mirror：TRF advanced single mirror (#615) or Lance/Delfia D400 single mirror (#412) |
EnVision HTS (SDE) | 1) HTRF Europium/Red Kit, includes: Excitation filter：UV2(TRF) 320 (#111) Emission filter：APC 665 (#205) 2nd emission filter：CY5 620 (#118) or 615 (#203) Mirror：TRF Lance D407/D630 advanced dual mirror (#666) or Lance/Delfia D400/D630 dual mirror (#662) 2) HTRF Terbium/Green Kit, includes: Excitation filter：TRF UV2 340 (#101) Emission filter：TRF 520(#275) or (#226) 2nd emission filter：495 (#276) for simultaneous readout Top Mirror：TRF D407/D505 advanced dual mirror(#664) or D400/D505 dual mirror (#657) |
拥有HTRF认证资质的荧光酶标仪、配套光学元件支持，再加上HTRF检测试剂，开展HTRF技术研究方可谓万事俱备、水到渠成。
四、HTRF检测程序与同类TR-FRET方法间的兼容性
目前，同样是基于TR-FRET技术开发的检测试剂， HTRF之外还有MD IMAP Assays、BellBrook Transcreener assay 、Invitrogen LanthaScreen TR-FRET Kinase Assay、Bioauxilium Thunder Enhanced TR-FRET assay、PE Lance TR-FRET Assays等。
单论测试光谱数据，这些TR-FRET试剂的检测光谱设置基本是通用的。那实际工作中，其他同类产品能否用HTRF的检测标准程序测定？
分析结果是：不行。
表4 市面TR-FRET类试剂产品测试光谱特征
TR-FRET Assay | TRF Cage Type | Excitation | 2nd Emission | FRET Acceptor | 1st Emission |
HTRF-Eu/red assay | Europium cryptate | 320 nm | 620 nm | XL665/d2 | 665 nm |
HTRF-Tb/red assay | Terbium cryptate | 340 nm | 620 nm | XL665/d2 | 665 nm |
HTRF-Tb/green assay | Terbium Cryptate | 340 nm | 620 nm | Fluorescein/GFP | 520 nm |
LanthaScreen TR-FRET assay | Europium Chelate | 320 nm | 620 nm | AlexaFluor 647 | 665 nm |
LanthaScreen TR-FRET assay | Terbium Chelate | 340 nm | 490 nm | Fluorescein/GFP | 520 nm |
Transcreener TR-FRET assay | Terbium Chelate | 340 nm | 620 nm | HiLyte647 | 665 nm |
LANCE assay | Europium Chelate | 320 nm | 620 nm | ULight | 665 nm |
LANCE assay | Europium Chelate | 320 nm | 620 nm | Surelight APC | 665 nm |
THUNDER TR-FRET assay | Europium Chelate | 320 nm | 620 nm | Far-red dye | 665 nm |
PE-Cisbio强调的是，HTRF认证测试流程、方法的应用范围严格限于HTRF试剂和技术使用，不适用于用于其他TR-FRET产品的测定。
TRF-FRET检测具有时间高度灵敏的特性。在各种不同来源样品测试条件下，不同TRF-FRET试剂盒的荧光光谱稳定性、半衰期特征的差异，注定了检测过程的积分时间、脉冲数量、时间延迟几个关键参数难以完全匹配。尽管两种试剂盒测定的激发波长、发射波长峰值特征一致，但不代表TRF-FRET过程中供体、受体两种荧光信号的动力曲线相同。
HTRF试剂采用有大环结构的穴状态镧系配合物，其光谱稳定性优异，与特殊优化的缓冲液配合，可以实现0.6-1ms的超长荧光寿命。其他的TR-FRET技术中所用的镧系配合物、FRET能量受体释放的FRET荧光信号动力学特征除非能高度还原HTRF产品FRET过程的荧光表现。否则，在同一型号荧光酶标仪上用HTRF提供的标准测试程序测定其他厂商试剂，难免弄巧成拙、东施效颦。
表5 Ciosbio HTRF VS LanthaScreen检测参数设置对比
Assays | Ciosbio HTRF-Eu/red Assay | LanthaScreen Eu Kinase Activity Assay |
Excitation filter | 337nm | Ex 340/30 nm |
Emission filter | 620/8.5nm，665/10nm | Em 665/10 nm，Em 620/10 nm; Dichroic LANCE/TRF |
Delay Time | 60 μs | 100 μs |
Integration Time | 400 μs | 200 μs |
对比Ciosbio HTRF-Eu/red Assay、LanthaScreen Eu Kinase Activity Assay在Perkin Elmer EnVision多功能荧光酶标仪上检测所用的测试参数，可发现：尽管两个试剂盒规定的激发波长、双荧光发射波长设置基本一致（测试年份不同，同一型号仪器出厂预装滤光片规格略有变动），但脉冲信号的积分时间延迟（HTRF-60µs VS LanthaScreen-100µs）、积分时间长度（HTRF-400µs VS LanthaScreen-200µs）的设定迥异。
这证实了我们分析的结论：不同TR-FRET试剂盒在荧光多功能酶标仪上的规定的测试条件设置存在较大区别，其标准检测程序相互难以有效兼容。
表5的信息还表明：与Ciosbio HTRF-Eu比，LanthaScreen Europium激发的背景荧光衰减慢、而FRET供体和受体的荧光寿命短；LanthaScreen Eu检测时间延迟拉长，极大地限制了检测积分窗口的选择余地和测试灵敏度的提升空间。
参考文献：
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［4］Degorce F, Card A, Soh S, Trinquet E, Knapik GP, Xie B. HTRF: A technology tailored for drug discovery — a review of theoretical aspects and recent applications. Curr Chem Genomics. 2009;3:22–32.
［5］HTRF Europium cryptate donor/Red acceptor readout Setup recommendations for Polarstar Omega (PerkinElmer & Cisbio).
［6］HTRF Europium cryptate donor/Red acceptor readout Setup recommendations for SpectraMax iD5 (PerkinElmer & Cisbio).
［7］HTRF Europium cryptate donor/Red acceptor readout Setup recommendations for Infinite F200 PRO (PerkinElmer & Cisbio).
［8］HTRF Europium cryptate donor/Red acceptor readout Setup recommendations for Envision equipped in Flash lamp (PerkinElmer & Cisbio).
［9］HTRF Europium cryptate donor/Red acceptor readout Setup recommendations for Synergy NEO2 equipped in Flash lamp (PerkinElmer & Cisbio).
［10］SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader User Guide (5059784H,01/2022).
［11］Omega Family of Readers Operating Manual (Rev G).
［12］柳苏月, 田晶晶, 田洪涛等. 铽(Ⅲ)离子及其复合物：从发光特性到传感应用. 生物技术通报, 2020, 36(4): 192-207.
［13］Agilent BioTek Detection Accessories Brochure (5994-4172EN).
［14］LanthaScreen TR-FRET Phospho-specific Antibody Reagents and Substrates User Guide (14 April 2009).
［15］EnVision Multi-label Plate Reader Brochure (007309D_01).
［16］Franka Maurer, Thomas Roux, Fanny Plénière, et al. Cellular and biochemical HTRF assays measured in 1536-well microplates.(BMG LABTECH GmbH, Cisbio Bioassays).
