拨开云雾见月明——英捷iBright FL1500 Western荧光成像分析仪技术特点解析-1

       Invitrogen iBright FL1500, 是美国赛默飞公司2019年上市的一款主要针对Western Blot免疫印迹多色荧光检测应用而推出的多功能成像分析系统。它随机标准配置包括l蓝绿色LED透射仪、SDS-PAGE染色凝胶白光屏（White trans-illuminator screen）、荧光滤光片套件、印迹参考样品（iBright Imaging System Sample Blot / Reference target）、安全防护眼镜（Safe Imager Viewing Glasses）和PC端iBright Image Analysis Software。既支持荧光印迹（一张印迹膜上可同时检测绿色、橙色、红色、远红外和近红外5种荧光）、HRP和AP底物的化学发光印迹和显色法（如Ponceau S、MemCode染色）蛋白印迹成像检测，还可用于荧光染色、显色和染色的核酸、蛋白质凝胶的成像分析。

       在Western Blot多功能成像分析领域， Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System (1708280，2013)/ChemiDoc MP Imaging System (12003154，2020)、GE Amersham Imager 600 RGB（AI600, 2014）/ ImageQuant 800 Fluor（AI800, 2019）、UVP ChemStudio Plus Imaging Systems（2013）等老牌强手环伺左右，此时Invitrogen iBright FL1500的入场，略显得姗姗来迟。  

       据阿拉斯加科技2022年10月完成的一项调查显示：从2013年11月-2022年10月，以“ChemiDoc MP[Text Word]”为检索条件在PubMed期刊数据库共查到52篇article。而以“iBright [Text Word] AND FL1500 [Text Word]”作关键词检索，共获得152条记录。

       业界流行“后发优势”一说。那iBright FL1500在吸收了“前辈”的技术精华后，到底炼就何等吸“睛”大法，逆袭跻身强林的？为此，我们推出《拨开云雾见月明——英捷iBright FL1500 Western荧光成像分析仪技术特点解析》系列文案，从硬件配置到软件模块4个角度，对iBright FL1500进行剖析，以期我们对该产品为代表的Western荧光成像分析仪、连带Western ECL成像系统有更深入的了解。

一、多功能荧光检测应用

       对上述使用iBright FL1500 Western荧光成像仪实施检测的152个应用实例，按检测样品类型分类统计结果显示：

表1  iBright FL1500 Western荧光成像仪检测应用举隅

        表1信息表明，iBright FL1500 Western荧光成像仪应用实例中，80%属于化学发光Blot检测（enhanced chemiluminescence Blot，ECL）；荧光测定类应用的占比不足20%，主要包括蛋白Blot、荧光标记蛋白凝胶、荧光标记核酸凝胶和微生物克隆板荧光检测。20%的比例虽不算高，但足以证明样品荧光类应用不可或缺。

       凝胶成像分析仪（如Bio-Rad GelDoc Go、Axygen GDBL-1000）和多数印迹化学发光系统（如Bio-Rad ChemiDoc、ChemiScope 6100BZ和ChemiScope 6200），标配通常是302nm波长紫外透射光源，无法激发Cy5（Ex 649nm，Em 670nm）、Cy3（Ex 552nm，Em 570nm）、SYPRO Orange（Ex 470nm，Em 570nm）等凝胶荧光染料，或激发SYBR Green（Ex 498nm，Em 522nm）、SYBR Gold（Ex 490nm，Em 540nm）、Gel Green（Ex 500nm，Em 530nm）难以达到最佳分析效果。最关键的是，Western ECL成像仪缺少特异性荧光滤光组件，而凝胶成像仪则荧光滤镜、冷CCD都缺失，因此，都无法胜任微弱荧光信号的采集。

       因此，既配置有透射紫外（Trans-UV）和(或)透射蓝光（Trans-blue）激发光源，又拥有多组特异性荧光激发-发射滤光组件和冷CCD的Western荧光成像分析仪，自然成为SYPRO Orange、SYBR Gold等荧光染料标记凝胶样品检测的理想方案。

表2 主流品牌Western多功能成像分析系统荧光检测模块配置表

        Western荧光成像分析仪，顾名思义，是可用于单重（singleplex）或多重（multiplex）荧光标记印迹的图像采集与分析。荧光印迹检测技术（fluorescent Blot）比ECL印迹分析法究竟有何技术优势？我们认为，荧光蛋白印迹检测的优势主要是“三高”，即高特异性、高效率和高分辨力。

1、荧光Blot检测的高特异性

       几乎所有原核和真核细胞样品，在荧光检测过程中都不同程度地存在与检测信号无关的自发荧光。样品内源成份（如组织细胞结构组成成分和代谢物）、样品处理中引入的外源物质（如组织固定所用的多聚甲醛等）和样品所用器材（如试剂和转印膜），都可能助长这种背景荧光信号。其中一些组分无需激发光诱导即可产生自发荧光，如作为细胞外基质主要成分的胶原蛋白（Em 350-450 nm），细胞内核黄素（Em 550 nm），动物及细菌样品中的维生素A（Em 500 nm）等。
        红蓝绿色自发荧光的存在，连同电泳、转印过程的误差，往往使ECL法印迹图像背景增强，Blot条带-背景反差削弱，检测信噪比(S/B)降低。当然，自发荧光与测试荧光基团的光谱如存在重叠，则背景荧光同样会干扰样品荧光Blot分析，降低测试灵敏度和准确性。

       荧光印迹分析依托荧光滤光片组件和低温冷CCD检测器进行。带宽优化光学滤片，可将激发光源、样品和印迹膜自发荧光等高效滤除，只允许波长特异性荧光信号进入CCD，Blot图像中背景信号被极大削弱。

(上图：通过多个荧光通道获取的荧光图像及叠加后效果；下图：用iBright FL1500采集的ECL Blot条带成像后再手工合并图像)

       对比荧光Blot和用于发表的ECL印迹（原图经反相转换成经典放射性自显影底片的效果）图像，不管是添加伪彩色的多色荧光叠加图还是单色荧光图，荧光Blot图像都显得更背景更“干净”，条带与背景对比反差更大。一张图上可呈现所有检测对象。
       图像的基础背景低，条带定量分析时，条带信号经背景扣除处理后所保留的有效值更高，对弱信号条带检测分辨力的提高极为有利。

2、荧光Blot检测的高分辨力

       蛋白质磷酸化修饰和去磷酸化，是调控信号转导、基因表达及细胞的增殖分化等生理病理过程启动的一个重要分子开关。通过检测蛋白质磷酸化，了解特定蛋白质在细胞受到多种生物和非生物胁迫刺激时的磷酸化水平变化情况，有助于理解蛋白质在其中所发挥的调控功能和内在机制。

       Western Blot 与ELISA、激酶活性分析及质谱，都是检测蛋白磷酸化状态的常用方法。蛋白经SDS-PAGE分离并转移到膜上，采用磷酸化特异的抗体可精确识别蛋白磷酸化氨基酸位点，实现对蛋白磷酸化水平的定性、定量分析。

       因磷酸化修饰所引起蛋白分子量变化非常微小，磷酸化及非磷酸化两种不同状态的蛋白，经凝胶分离后的条带往往紧贴、重叠，这给ECL化学发光标记法区分这两种蛋白组分带来难以克服的困难。而此时，Western多色荧光检测技术则正好可以大显身手。

      如图所示，原本空间位置相互重叠的MAPK信号通路ERK家族成员，ERK1/2(p44/42)总蛋白和发生磷酸化修饰的ERK1/2（Phospho-p44/42），分别经自特异性一抗锚定，再采用DyLight 800、StarBright B700两种不同的荧光基团标记的二抗检测，借助于两个荧光通道，分别采集到出红色（磷酸化修饰的ERK1/2）、绿色（ERK1/2总蛋白）两种信号。两个通道的图像经叠加可见，在图像同一个位置，同时呈现出红色、绿色和红绿复合形成的黄色信号窄带。叠加图上红、绿两种信号的条带边界重叠难以分辨，但在不同荧光通道内，各条带边界则清晰分明，为分析各条带提供了极大便利。

      而目前已知的蛋白翻译后修饰方式多达20种以上，除磷酸化，乙酰化、泛素化、甲基化也都属常见蛋白修饰方式并参与机体多样化生命过程调控。使用多重荧光印迹检测技术，研究人员用3-4个荧光基团标记多种蛋白质，每种蛋白质的检测信号在不同荧光通道中采集，从而达到在同一印迹上一次检测多种蛋白质（不受蛋白间的分子量大小的影响），可区分在复杂生物学调控路径中各蛋白的角色定位。操作过程无须裁膜、无须逐一剥离蛋白组分，简便高效。

3、荧光Blot检测的高效性

      Western荧光成像分析系统所配置的荧光检测通路，决定了印迹可同时分析的目标蛋白的种数和印迹检测所适用二抗荧光基团的光谱属性。

      表2信息显示，主流品牌型号的荧光通道配置数量、滤光片光谱截止范围虽有一定差异，但可发现以下共同点：

      1）绿色荧光通路（Em525/BP20nm）：适用于SYBR Gold、SYBR Green、GelSafe等；
      2）橙黄色荧光通路（Em605/BP40nm）：适用于Cy3/SYPRO Orange/Alexa Fluor 546/EB等；
      3）红色荧光通路（Em705/BP40nm）：适用于CY5/Alexa Fluor 647等；
      4）远红外(FIR)荧光通路（Em715/BP30nm）：适用于IRDye 680/Alexa Fluor 680等；
      5）近红外(NIR)荧光通路（Em836/BP40nm）：适用于IRDye800/Alexa Fluor 790等。

      目前主流Western荧光成像分析仪的荧光检测通路配置数量普遍高于2012-2013年版机型。譬如，2012版ChemiDoc MP Imaging System为3荧光通道（6位滤光片轮，预留1个空位用于化学发光检测，1个标准显色/白光滤片，外加绿530nm、红605nm、深红695nm三组荧光滤片）。2013版Amersham Imager 600 RGB设置的也是绿Cy2 (525BP20nm)、红Cy3/EB (605BP40nm)、深红Cy5 (705BP40nm) 三个通道。而2019版上市的ChemiDoc MP、Amersham ImageQuant 800（AI 800）和iBright FL1500，均采用了8位滤光片轮，荧光通道数量扩充至5个。

      荧光检测通道数量和适用光谱种类的增加，带来至少2方面的便利。

      首先，由于样品自发荧光多集中在蓝色、绿色和红色的可见光（波长380-700nm）范围，新增的远红外、近红外外荧光检测通道，基本避开电泳样品中其它生物分子和转印膜自发荧光的背景干扰，使获得更高图像信噪比成为可能。

      其次，荧光通道增加，使得多通道荧光应用的组合更灵活。

      以iBright FL1500为例，荧光发射端共设置了Em1：508-537nm(Alexa Fluor 488) 、Em2：568-617nm(Alexa Fluor 546) 、Em3：675-720nm(Alexa Fluor 647) 、Em4：710-730mn(Alexa Fluor 680) 和Em5：800-850nm(Alexa Fluor 790)共5个通道。

      预留一个通道用于内参蛋白信号检测，再从检测光谱存在明显重叠的Em3 (675-720nm)和Em4 (710-730mn)中2选1后，iBright FL1500可以同时对采用Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 647和Alexa Fluor Plus 800标记四种蛋白同时检测。

      Em3、Em4两个通道的检测光谱存在一定程度的重叠，而荧光染料存在主、次激发峰。当中一个通道测试时，另一种染料的次激发效应信号也同时被主检测通道捕获。这样使数据分析的逻辑出现混乱：原已被分离的两个蛋白，竟都包含有另一种蛋白信号。而事实上纯属光学通道间信号窜扰（cross-talk）所致。因此，两个存在光谱重叠的检测通道，在一次测试中只能用其中一个以杜绝信号窜扰现象。这样一来，Western Blot成像分析仪虽配置有5个通道，实际却只能同时使用4个通道。此现象不仅存在于iBright FL1500系统，同样也能在新版ChemiDoc MP和ImageQuant 800 Fluor上观察到。

      还须注意的是，就Western印迹多色荧光分析实验而言，5通道配置系统实际可同时检测的蛋白最多只能达到3种（如内参β-actin+pAKT+AKT三种荧光同时检测模式）。这是因为严格的Western Blot实验还需要进行TPN处理，而总蛋白的测定通常需占用一个检测通道。