赤橙黄绿青蓝紫 谁持彩练当空舞——激酶活性HTRF检测的荧光酶标仪方案-中

基于应用的多功能荧光酶标仪选型-3

 （续：激酶活性HTRF检测的荧光酶标仪解决方案-上）

二、HTRF技术对测试仪器系统的要求

       Cisbio Bioassays公司（2019年4月并入美国PE/PerkinElmer）不生产测试仪器，而是通过对PerkinElmer、Biotek、BMG、Molecular Devices、Tecan、Thermo Scientific等主流品牌制造商的多功能荧光酶标仪实施HTRF检测资质认证的方式，借船出海，让HTRF技术应用一路保持着乘风破浪、行稳致远的态势。

       为HTRF技术应用保驾护航的，是Cisbio为HTRF专利技术建立的一套检测标准体系。该标准对测试用仪器硬件配置、系统工作参数设置和数据处理方法等都有完整而详尽规定。

2.1 HTRF检测对仪器硬件条件的要求

       HTRF技术是依托TRF、FRET两种荧光分析方法建立的，故执行HTRF测试的仪器，从光源、光路配置、检测器及软件系统设置，除要适应TRF、FRET检测要求，还要符合HTRF检测技术标准。

       HTRF抑或TRF，都基于测试信号与普通荧光、样品背景荧光的衰减时间(fluorescence decay time)的巨大差异原理，在荧光激发和信号检测两个动作间引入一个50 - 150µs的检测时间延迟，待被散射的激发光和短寿命样品自发荧光自然消退殆尽，再测定FRET机制释放的荧光信号。用时间门控的方法排除非特异荧光的干扰，来实现高信噪比、高灵敏度。此外，HTRF、TRF技术都用了镧系元素离子型配合物作荧光标记，测试所用的激发、发射滤光片配置基本一致。只不过，HTRF需加一组检测光学元件以测定第二发射荧光信号。而HTRF与FRET虽检测原理方法一致，但具体细节则大相径庭。

       归纳起来，满足HTRF认证标准的多功能荧光酶标仪，硬件配置有以下特点。

2.1.1 检测光源

       HTRF检测光源可以采用闪烁氙灯（Xenon flash lamp）或高能激光器（TRF laser）。

       氙闪灯闪光频率高（最大200Hz），波长分布范围广（240 -1200nm）。其中检测常用的紫外（200-320nm）、可见光谱（430-680nm）两个区间能量处于较高水平。而镧系元素穴状化合物激发波长为340nm。因此，氙闪灯用作HTRF检测是经济易行的光源来源。但缺点是能量分布均匀，特别是320 - 340nm区带的能量辐射相对较弱。

       而波长337nm的TRF激光器，能量集中，样品激发充分，对强、弱两种信号的辨识度增强，检测的灵敏度和动态范围都有改进。此外，每次快闪式激发结束后，能量消退迅速，没有闪烁氙灯常见的能量消退“长尾”，故激光器脉冲引入的背景持续时间短、强度弱。只需更少激发频次，即可达到检测积分效果。实测表明，TRF激光器激发一次采集的荧光信号足以媲美常规氙闪灯激发10次采集信号积分效果，可在36秒内完成1536孔板测定，有显著速度优势并保持Z'>0.8的测试质量。这是HTRF检测系统引入TRF激发光源的价值所在。

2.1.2 传输光路

       HTRF检测光路须是滤光片架构(filter-based)，通常系统配置专用一组340nm激发滤光套件(Excitation filter set)、620/665nm两组发射滤光片组件(Emission filter set，含二色分光镜)。VantaStar、FluoStar Omega、EnVision、SpectraMax iD5、Synergy NEO2、Infinite F Plex系统均采用此配置思路。

       MD的SpectraMax i3x、SpectraMax Paradigm多功能荧光酶标仪，因为采用的光源-光路集成式卡盒式模块化设计，因此只需选择HTRF专用检测卡盒(0200-7011)，其内置符合Cisbio HTRF测试标准的氙闪灯、传导光路设计和616nm, 665nm两组特异性发射滤光片，可实现即插即用。

2.1.3 信号检测器

       HTRF与FRET、BRET检测，都需对能量的供体、受体两个发射荧光信号进行采集测定。理论上，为避免样品因时间不同、激发能量波动、检测器自身工作暗电流波动产生的噪音干扰，两组信号应该实施同步测量。为此，通常测试仪器要求是双重滤光光路、双PMT配置来并行测量 2 个发射波长，即同步双发射(Simultaneous Dual Emission，SDE)测定。主流品牌多功能荧光酶标仪中，BMG VantaStar、FluoStar Omega、Polarstar Omega、PerkinElmer EnVision HTS和Agilent BioTek Synergy NEO2属于这种情况。

       SDE不仅降低测试值%CV，同时更有利于HTS应用。实际上，HTRF技术开发过程中，正是依托SDE检测平台进行的。

       目前，除经典SDE同步测定方法，非同步测定方法——Two sequential measurements（TSM）也已被Cisbio HTRF标准体系采纳。所谓TSM，即两种荧光信号按（受体）发射荧光—供体发射荧光的顺序分为两次、连续循环测定方法（Sequentially measure the two emissions one after the other）。

       HTRF检测中，Eu³⁺等镧系元素穴状化合物发射荧光寿命不过1000 μs，而测试仪器PMT检测时间窗口（Window time or Integration time）长达400-600 μs，已基本覆盖或代表了的黄金采样窗口。在一个采样循环时间内，显然无法按顺序依次完成供体荧光、受体荧光信号采集。故两种信号的测定只能分步进行：第一个激发周期（cycler或flash）的600μs窗口检测供体信号，第二个激发周期采集受体荧光信号。只要确保每个采样周期设定参数一致，系统工作状态基本稳定，则从两个连续周期分别测得的两个荧光信号，与在一个周期内同时采集的两种荧光信号，理论上等效。Tecan Infinite F200 PRO 、MD SpectraMax iD5系统的HTRF认证测试程序中， 620 nm、665 nm两种信号数据就是基于TSM模式得来的。

       这表明，作为TR-FRET技术中特例，HTRF检测检测数据，既可以用经典SDE方法测定产生，也可以是TSM非同步连续测定完成。这等于宣示：造价相对低廉的单PMT配置系统同样可以申请HTRF检测认证。

2.2 HTRF检测对应用程序设置的要求

       Cisbio对MD、Tecan、PE、BioTek和BMG等品牌测试仪器的HTRF认证应用程序，会因各仪器配置、技术性能、默认运行参数设置不一，实行了个性化量程定制的HTRF检测协议，以确保检测数据质量符合Cisbio的信噪比、DF%、CV%、灵敏度和动态范围等多项认证标准。资料显示，即便是相同HTRF应用，如Europium cryptate donor/ Red acceptor readout，不同仪器HTRF测试协议中诸多参数设置互不兼容。

       我们首先看看HTRF检测协议都有哪些核心要素。

2.2.1 检测脉冲数（Number of flashes）

       在对单个样品测定过程中，激发光源的一个开启激发关闭动作、一个短暂待机和检测器的一个启动信号采集到停止动作，这三个内容组成的一整套测试活动可称为一个闪光（flash）、脉冲（pulse）、读数（read）或一个检测循环周期（cycle）。

       每一个样品孔通常都包括许多个重复脉冲动作。不同仪器设定的脉冲数有差别（10-200个）。

2.2.2 激发时间（Excitation Time）

       激发光源在每个脉冲中持续工作激发样品时间，称为激发时间。

       HTRF检测中，闪烁氙灯用的是50μs固定时间，确保样品充分激发。高能激光器脉冲激发能量集中而强度高，档次激发时间可缩短至数微秒。

2.2.3 检测延时（Integration delay/Measurement delay/Lag time）

       激发光源关闭后、检测器启动荧光信号采集前有一段无光电操作的空白时间，称为时间延迟。

       通过测量时间延迟，就可以在激发光、待测样品基质自发短寿命荧光（1-10ns）全部衰变后，消除其干扰，得到背景极低而信噪比极佳的特异性荧光强度测值。

2.2.4 检测时间（Integration Time）/信号采集窗口时间(time of windows）

       是指在一个脉冲中，从检测器启动信号采集工作到结束信号采集这段时间长度，称为积分时间或检测窗口期。

       每个样品孔要历经10次以上的脉冲，而每个脉冲的积分时间是固定的。

       PMT光谱响应特性（同一个制造商生产同一种型号光电倍增管，光谱响应特性也不完全一样）、量子效率（Quantum Efficiency）、暗电流变化（限制了对弱光信号的检测的分辨能力，即灵敏度）、信号响应时间（把光脉冲转换并输出光电脉的时间，约10ns）等性能影响对测量结果大。积分时间需综合信号强度、暗电流噪音、Delta F几个指标动力学特性才能确定。最佳积分时间方案是噪声最小化的同时Delta F 最大化。资料显示，SpectraMax iD5系统最佳积分时间为在500 μs至1000 μs范围内，噪声最小化而Delta F较高。

       测试表明，随着脉冲次数增加，Delta F 值显示出变异性较小趋势（CV 越好），同时背景噪音减少，检测限提高。因此，优化每孔样品的积分时间和脉冲数这两个参数可提示系统检测性能。

       每个样品测度时间为（测试板位置机械移动、定位的时间不计入）：

        （延迟时间+积分时间）×脉冲数量 = 单孔样品检测时间。

2.2.5 信号增益调节（Gain）

       Gain即光电倍增管的增益。PMT通过光电阴极面接收光信号将光子能量转换成光电子后，经过多次聚集、加速、轰击而实现电子数目叠加倍增，在PMT阳极端输出电流，而PMT的输出电流大小和入射光子数成正比。

       PMT增益用末端输出电流与前段阴极电流比值表示，可理解为电流的倍增率。通常，增加PMT阴阳两极的工作电压，则增益增加。

       PMT自动增益调节功能，是指仪器根据样品信号强度，自动选择合适的PMT工作电压。此外，PMT允许手动增益优化设置。增益调节的作用是系统可在一定数量级别内同时稳定测定高、低信号相差7个数量级上的不同样品。

2.2.6 Z轴高度调整（Z-position）/读板高度（Read height）

       HTRF检测要将高能激发光源、测试探头都精准聚焦于样品上，以实现有效激发和信号采集。Z轴-聚焦调整功能，能优化读板的Z-高度，以适应不同通量、孔样品直径、样品页面高度的测试板的检测，减少测试信号损失，并降低孔间串扰。

表1 Cisbio HTRF认证的HTRF检测专用参数设置

       根据表1内容，我们可以作如下解读：

       1）不同品牌多功荧光能酶标仪的检测脉冲数、延迟时间、积分时间不同，使得单孔样品检测效率不同。按HTRF检测速度从高到低将表中五款机型排序，结果是：Infinite F200 PRO ＞Synergy NEO2 ＞ EnVision HTS ＞ SpectraMax iD5 ＞ FluoStar Omega；

       2）依据单孔样品信号检测时间参数，按测试灵敏度从高到低这5款机型排序结果为：FluoStar Omega ＞ EnVision HTS ＞ SpectraMax iD5 ＞ Synergy NEO2 ＞ Infinite F200 PRO；

       3）为Ciobio HTRF检测建立的标准测试protoco中，延迟时间、积分时间、脉冲次数之间存在制约、互补关系。以FluoStar Omega、Polarstar Omega为例，虽然时间延时少（60 μs），积分时间短（400 μs），但脉冲次数多（200次）。而SpectraMax iD5时间延时长（100 μs），积分时间长（600 μs），但脉冲次数少（50次）。因此，确保每个样品的总积分效果在不同平台间测试结果的可比性、可靠性。这正是Cisbio HTRF认证创建个性化检测协议的魅力和意义之所在。

       相比为各品牌不同型号的多功能荧光酶标仪拟定千篇一律测试协议的指南规范，Ciobio的HTRF标准体系采用“一机一议、因机施策”的方法，显然更科学严谨、更具可行性。

 (续：激酶活性HTRF检测的荧光酶标仪解决方案-下)