赤橙黄绿青蓝紫 谁持彩练当空舞——荧光强度检测的多功能荧光酶标仪方案-下

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二、滤光片式多功能荧光酶标仪

2.1 滤光片荧光光路系统的特点

       滤光片光路系统具有高光通量，光损耗少，高信噪比的优点。随着滤光片新材料的应用和工艺改进，人们已可根据检测要求对激发、发射光滤光片的截止波长、带宽进行特殊优化组合（带宽可以从10- 50nm的大范围内选择），以获得最佳的信噪比。因此，从荧光酶标仪诞生以来，滤光片光路系统就成了荧光检测的标配，特别是FP、TRF、TR-FRET等对灵敏度要求极高的应用。

       滤光片系统还有一个优势就是滤光轮可以快速切换滤光片，同步检测两种荧光信号，如典型的钙离子流检测、BRET双波长荧光比例分析等检测，这些都是基于光栅单色器的系统所不能完成的。因此，滤光片荧光检测系统的应用更广。

       此外，基于滤光片光路的多功能荧光酶标仪还具有价格便宜的优势。

       当然，荧光染料检测光谱特征不同，不同试剂盒、不同应用中的荧光检测波长不一。而滤光片型酶标仪无论是配置滤光片轮抑或是抽插式滤光片滑条，考虑到发光检测所需的1个空白位，实际可加载的滤光片至多不过5个。这样将难以避免有部分实验会因缺少相应波长的滤光片套件而无法进行。而滤光片单独购买、更换擦着，却并非所有品牌机型的新手可轻而易举完成。

表2多功能荧光酶标仪标准滤光片配置一览

品牌 型号	Molecular Devices SpectraMax Mini	Tecan Infinite F Plex	Biotek Synergy LX	BMG FluoStar Omega	Promega GloMax Explorer
荧光模块
滤光片容量	1个	4个	2个	8个	5个
Blue	Ex 360/35nm Em 465/35nm Coumarin/AMC, AF350	用户自定义	Ex 360/40nm Em 460/40nm (MUB, caspace-3)	Ex 355/35nm Em 460/35nm	Ex 405nm Em 500/5nm
Green	Ex 485/20nm Em 535/25nm (Fluorescein/FITC)	Ex 485/20nm Em 528/20nm (Fluorescein,   EGFP)	Ex 485/20nm Em 528/20nm (Fluorescein,   EGFP)	Ex 485/20nm Em 528/20nm	Ex 475nm Em 525/25nm
Red	Ex 535/25nm Em 595/35nm (Alamar blue, PI)	用户自定义	EX 530/25nm EM 590/35nm (Alexa Fluor 546/CY3)	EX 544/35nm EM 590/35nm	Ex 525/20nm Em 610/30nm
NIR	/	用户自定义	/	EX 584/35nm EM 620/10nm mCherry,Alexa Fluor 594	Ex 620/40nm Em 690/30nm CY5, Alexa Fluor 680

       标配的滤光片不够用，可能是这类多功能荧光检测系统的最大短板。纵然BMG FluoStar Omega装备有8位滤光片轮（标配4对检测滤光片），与QuantStudio 5、QuantStudio 7 Flex实时荧光定量PCR仪的6个荧光检测通道能把Fluorescein, VIC, TAMRA/Cy3, Texas Red,Cy5, Cy5.5五种代表性染料全覆盖比，也望尘莫及。

       而化解这一困境的办法其实很简单。

       用户可根据主要测试任务和常用试剂盒的荧光染料类别，增配若干个空滤光模块（每个荧光模块都具有数量不等的激发-二分镜-发射滤光组件安装位置），再从增配相应波长的滤光片就水到渠成。以Synergy LX为例，从310/20nm开始到818/40nm，以波长10或20nm幅度递增，有数十种滤光片可供选配或定制。

       表2也告诉了人们一个基本事实：厂商提供的初始标配大体是一致的，采用的是RGB三色荧光配置。说明，这样设计可照顾常用染料的荧光测定要求，用户DIY优化配置的额外工作并不复杂。

2.2 荧光强度检测常用多功能荧光酶标仪方案

      目前，基于滤光片光路设计的主流品牌多功能荧光酶标仪机型包括了以下几款。

表3 多功能荧光酶标仪主要测试性能指标一览表

品牌 型号	MD SpectraMax Mini	Biotek Synergy LX	Tecan Infinite F Plex	BMG FluoStar Omega
外观
预装滤光片数	3	3	自定义	4
激发波长(Ex)	250～850nm	320～700nm	230～850nm	240～740 nm
发射波长(Em)	250～850nm	320～700nm	280～850nm	240～740 nm
荧光检测器	低温PMT	PMT	PMT	PMT
检测灵敏度	1 pmol/well fluorescein	2 pmol/well  fluorescein	顶读0.85 pmol/well (100μl, 384孔板) 底读5.0 fmol/well (200μl,96孔板)	0.2 fmol/well fluorescein
检测动态范围	6 decades	6 decades	/	8 decades
恒温孵育功能	RT+5℃～45℃	RT+5℃～50℃	RT+5℃～42℃	RT+5℃～45℃
微孔板振荡功能	线性、圆周和双圆周	线性、圆周和双圆周	线性、圆周	线性、圆周和双圆周
可选配注射器	否	否	是	是

(注：1 pmol =10³ fmol = 10⁶ amol)

       整体看，表中所列四款机型的测试功能旗鼓相当，都具备荧光强度测定、发光检测、紫外可见吸光度测定、动力学分析功能，且都有微孔板振荡模块和维持样品室恒温功能。

       就荧光检测灵敏度、检测动态范围两项指标而言，BMG公司 FluoStar Omega多功能荧光酶标仪要更胜一筹，其次是Tecan Infinite F Plex。此外，考虑到双自动进样器在动力学测定、双荧光素酶报告基因分析中的重要作用，仪器应用的可扩展性也优于MD SpectraMax Mini、Biotek Synergy LX两机型。

       根据近年国内公开渠道的信息，Synergy LX、Infinite F Plex两款机型，标准出厂配置（不含标配之外的光学模块、实际进样器）情况下，售价低于30万元。

参考文献：

［1］Omega Family of Readers Operating Manual (Rev G)

［2］GloMax Explorer System Operating anual (Rev 6/22)

［3］Instructions for Use for Infinite 200 PRO Rev 1.6

［4］SpectraMax Mini Multi-Mode Microplate Reader User Guide (5090339 B)

［5］Synergy 2 Multi-Mode Reader Operator's Manual (Rev K)

［6］Xavier Amouretti. 多功能微孔板发光酶标仪：基于滤光片系统，基于单色器系统，还是合二为一？