赤橙黄绿青蓝紫 谁持彩练当空舞——双荧光素酶报告基因检测之多功能荧光酶标仪方案-上

基于应用的多功能荧光酶标仪选型-2

       荧光素酶报告基因检测是以荧光素为底物来检测萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase）活性的一种基因表达调控指示系统。它利用荧光素酶与底物发生化学中会产生发光的特性，把感兴趣的基因转录调控元件（如启动子基因片段、靶基因3’UTR等）克隆在萤火虫荧光素酶基因的上/下游，构建荧光素酶报告基因质粒，然后转染细胞。经适当实验刺激或处理后，测定荧光素酶-荧光素反应发光的强弱（代表荧光素酶活性的高低），来判断实验刺激/处理对基因表达调控元件的影响。

       1996年，Promega公司在单一荧光素酶报告基因的基础上引入“内参对照”——海肾荧光素酶（Renilla Luciferase）报告基因，推出了双荧光素酶报告基因检测系统（Dual-Luciferase Reporter Assay System，DLR）。

       DLR检测系统既可以是将分别带有海肾荧光素酶基因的质粒、含靶基因调控元件片段的萤火虫荧光素酶报告基因的两种质粒共同转染细胞，也可以是将各自带启动子的两种荧光素酶报告基因构建到同一个质粒上转染细胞，再测定两种荧光素酶活性。将荧光素酶报告基因转录的活性相对于内参——海肾荧光素酶基因表达的活性做归一化处理，以消除因细胞活性、转染效率差异、移液体积、细胞裂解效率和检测效率等其他因素造成的实验变异，提高了实验数据的可靠性。

       DLR检测系统具有灵敏度高、动态范围广的优势，被广泛用于基因转录因子与启动子转录调控机制、非编码RNA靶向互作、启动子结构分析、信号通路分析等研究领域。

       DLR检测中需按特定操作流程和测度时间要求，依次检测两种不同的荧光素酶与各自底物结合发生化学反应释放的化学发光信号。为确保测试性能，Promega公司创建了一整套DLR测试标准体系，并开发出GloMax20/20、GloMax 96、GloMax Multi、GloMax Navigator、GloMax Explorer和GloMax Discover等一系列配套发光检测仪。

       以“Dual-Luciferase Reporter Assay[Text Word] ”为条件检索PubMed期刊论文数据库，查到的文献记录达36793条之多。然而，这数万余篇实验论文中，DLR测试用GloMax系列机型的占比不到1/4，超过3/4的DLR分析实验是在MD、BioTek、Tecan、BMG等主流品牌的多功能酶标仪上完成。

       这种墙内开花墙外香现象的出现，既彰显DLR分析技术应用之盛，也说明DLR标准体系已被众多品牌多功能酶标仪系统采纳和引进，从而进一步促进了DLR检测推广。

       由此，我们来讨论3个问题：DLR有何特殊检测流程，DLR对测试仪器有何特殊要求，有哪些经济型多功能荧光酶标仪可作为DLR的解决方案？

一、 DLR检测标准流程的特殊性

       萤火虫荧光素酶在细胞内转录后无需翻译后加工即具有酶活性，在氧气、ATP和镁离子协同下，催化甲虫萤光素发生氧化反应。此过程中，部分能量以“闪光”型黄绿色（波长550-570nm）光信号的形式释放，在底物和酶混合后会迅速衰减。通过在试剂中添加含辅酶A (Coenzyme A, CoA)，则反应的发光由闪光转变为稳定可持续的辉光信号，且强度高，便于手工操作检测。海肾荧光素酶则在氧气存在时催化腔肠素发生氧化产生稳定的蓝光信号。

       故标准DLR检测流程中，发光检测仪读数步骤程序设置为进样后2秒开始采集光信号（For the standard DLR™ Assay, we recommend programming luminometers to provide a 2-second pre-read delay, followed by a 10-second measurement period.）。

       由于这两种荧光素酶催化反应中的发光光谱分布宽泛，可见光谱区段存在重叠。故promega的DLR检测采用的是4步操作流程：

       不带自动进样器配置的GloMax 20/20系统操作程序界面显示，发光测读步骤工作模式是1秒钟一次，共采集10次发光信号，每次PMT采集持续时间为1秒。

       配置有1或2个自动进样器时，系统控制程序界面显示，每个进样操作完成后有2秒时间延迟，然后开始测读发光信号。信号测度分为2个步骤，每个步骤都是间隔时间1秒共进行10次测读，单次信号测读时间1秒。

       为高通量DLR检测开发的发光酶标仪GloMax Navigator、多功能荧光酶标仪GloMax Explorer的系统的内置控制程序中，整合有Dual-Luciferase Reporter Assay System操作流程，可以直接调用。

       DLR检测标准程序不仅适用于Promega自创发光酶标仪、多功能荧光酶标仪。作为独立功能模块，还通过认证合作，嵌入到多个品牌的荧光酶标仪系统控制软件中。

       借助于仪器预置的DLR标准化程序，系统可在“开始”指令后自动进行加样并依次读取萤火虫和海肾萤光素酶活性数值，避免手动记录测量值而暂停检测操作。软件还提供归一化的萤光素酶值计算功能，并可对组内测定值进行统计分析。

       采用GloMax 20/20发光检测仪纯手动操作，完成每管样品的检测耗时约为30秒。期间因需手动记录萤火虫荧光素酶活性检测数据，势必造成步骤3、4操作的延迟。故配备外置电脑控制双进样器移液、并自动记录测试值，显然是必要的。对于高通量测试实验系统，则更应如此。

（待续：双荧光素酶报告基因检测之多功能荧光酶标仪解决方案-下）