赤橙黄绿青蓝紫 谁持彩练当空舞——荧光强度检测的多功能荧光酶标仪方案-上

基于应用的多功能荧光酶标仪选型-1

       相对于检测比色皿、试管内样品用的荧光光度计，人们把具有96、384、1536孔板的高通量荧光信号检测功能的荧光检测仪称作荧光酶标仪或微孔板荧光读板机。

       荧光（fluorescence）与发光（luminescence，包括化学发光、生物发光）的检测用的都是能将极微弱光信号连续十倍放大、并转换为可被测量电流的器件-光电倍增管(Photomultiplier Tube，PMT)。而发光反应，无须任何光源激发即可释放光能。因此，荧光酶标仪通常天然地具备发光检测功能。此外，再配上光栅单色器（monochromator）-光电二极管（Photodiode）检测模块，还可进行样品200-850nm范围光吸收峰扫描（spectral scanning）、任意波长的紫外可见光吸光度测定。这种同时具备荧光、发光和吸光度三种测定功能的荧光酶标仪，习惯称之为多功能荧光酶标仪、多功能微孔板检测仪、多模式微孔板读板机(Multi-Mode Microplate Reader)。

       为满足药物靶点筛选、分子生物学应用、细胞信号转导研究等分析要求，业内已开发的多功能荧光酶标仪，如BioTek Synergy Neo2，Molecular Devices SpectraMax iD5与SpectraMax i3x，BMG CLARIOstar Plus和Tecan infinite F Plex（200 Pro系列）等，无论是内部光路结构（波长选择方式有滤光片式、双光栅式、4光栅、光栅+滤光片组合式；检测器类型有光电二极管+单PMT型，二极管+双PMT型，二极管+4PMT型）。相应地，检测功能也得到极大拓展。除荧光强度（Fluorescence intensity，FI）、紫外可见吸光度（UV-Vis absorbance，ABS）、荧光、发光基本功能，还增加了荧光偏振（Fluorescence polarization，FP）、时间分辨荧光（Time-resolved fluorescence，TRF）、荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）、生物发光共振能量转移（Bioluminescence Resonance Energy Transfer，BRET）、均相时间分辨荧光(Homogeneous Time-Resolved Fluorescence，HTRF)，AlphaScreen & AlphaLISA等多种荧光分析方法）。读数模式（由简单的终点式Endpoint、动态读取和光谱扫描, 扩充到逐孔多点扫描well area scanning、多波长扫描灯）、读板方法（常规ABS、微孔板顶部读取Top reading、微孔板底部读取bottom reading）更多样化。此外，为确保样品测定状态的稳定，往往还集成了样品振荡处理、检测室温度控制和细胞等特殊样品通气保护模块。

       先进的光学元件、灵活的系统架构，加功能强大的数据采集与分析软件，让多功能荧光酶标仪在微量DNA/RNA及蛋白紫外纯度浓度测定、ELISA/酶学动力学检测、细胞活力和毒性观测、激酶等药物靶点分析、报告基因检测等众多领域获得日益广泛的应用。

       因此，用于荧光检测的酶标仪选型，应充分结合实际分析技术类型和样品的具体要求来考虑。本篇从最基础的荧光强度测定入手，讨论目前主流多功能荧光酶标仪的可选方案。

       就实现荧光强度测定的技术路线，多功能荧光酶标仪可分为经典型滤光片波长选择系统（filter-based）和光栅单色器（monochromator-based）波长选择系统两种类型。

一、光栅型多功能荧光酶标仪

1.1 光栅型荧光酶标仪的特点

       这一类荧光酶标仪的荧光强度检测，通常使用罗兰凹面反射光栅基于光学衍射原理把白色复合光源分解成一系列连续、扇形排列的单色光谱区带，再经狭缝选取其中特定光谱区间的单色光束用作荧光激发光照射样本。同样地，样品发射的荧光，经光栅-狭缝选择过滤后，其中特异波长范围的光被输送到PMT检测器用于测定。光栅由步进电机驱动下转动角度，被分解的单色光依次从狭缝出射，即可得到连续、不同波长的单色光。这种光栅系统结构简单，选取的光波长范围较窄，光色纯正、杂散光少。                                              

       光栅型荧光酶标仪的主要优势有三点。

       首先是测试波长选择具有极大灵活性。实验者可分别针对不同荧光染料激发、发射光谱属性，任意选择最灵敏的测试波长。

       其次，单色器可以进行荧光光谱扫描(Spectrum)。光谱扫描检测设置中，既可以固定激发波长(Excitation)而连续扫描样品发射波长(Emission)，获得样品在连续多个波长处的检测峰值分布，也可以固定发射波长(Emission)而扫描样品的激发波长(Excitation)峰。这特别有利于鉴定新的荧光物质或在某些分析中染料激发、发射波长迁移，对优化测试条件和改进测试性能具有重要价值。

       再次，是光栅单色器所提供的光谱带宽普遍较窄。市面多数荧光检测光栅提供的是5nm-20nm波长跨度的单色光。窄带宽可确保光色纯正，对具有窄发射峰的荧光探针（如Invitrogen Qdot这类纳米荧光探针）的检测和进行多色荧光检测，可减少信号串扰，提高测试结果的特异性。

       凡事有利就有弊。

       由于众多荧光染料的激发光和发射光光谱的分布在较宽泛的波长范围。对这类荧光的检测，较宽带宽更有助于增强激发响应、荧光发射能量，往往改进荧光检测灵敏度和获得更低的检测限。而无论是光栅光路的激发光，还是样本释放的发射荧光，与滤光片光路比，收窄的波长区带，会造成激发或发生峰处于半峰宽(光谱峰高一半处的峰宽度称半宽度，full width at half maxima/FWHM)以外范围的光能损耗。

       光栅带宽越窄，激发、发射荧光信号被滤掉的有效信号越多，必然在一定程度上降低检测准确性和灵敏度。

       这一点在业内早有定论。

       只要将同一品牌、同一型号和同一台机器上安装的光栅光路和滤光片光路对同一个样品荧光的检测数据对比，即可清楚地证明。

表1 光栅光路与滤光片光路检测灵敏度对比表

       正因为此，不仅是TRF、BRET、TR-FRET/HTRF、AlphaScreen & AlphaLISA等对荧光检测灵敏度要求较高的分析，对检测带宽有特定要求化学发光DLR分析认证，都将光栅光路技术法拉黑剔除。

1.2 荧光强度检测用的光栅型荧光酶标仪方案

       基于光栅单色器架构的荧光酶标仪，多见于中高端的多功能荧光酶标仪系统中。

       目前主流品牌多功能荧光酶标仪中，定位于荧光强度测定这一基础功能的机型并不多。这其中有美国MD SpectraMax iD3，Tecan Infinite E Plex、PE Ensight等。

       光栅型荧光酶标仪的售价通常都显著高于采用经典滤光片光路的同类产品。公开的信息表明，这类机型的市场价普遍均在35-40万元区间。

       因此，若以荧光强度测定为主要目标，光栅型荧光酶标仪从价位上看未免过于昂贵。

（待续）