ImageJ创建Western Blot条带定量分析选区的基本规则

让ImageJ在Western Blot图像分析中绽放-2

        《在Western Blot条带定量分析中图像灰度值的应用实测-下》一文提到，用ImageJ软件对图像定量分析流程中， 分析选区（ROI）的合理设置是基础。但用Image J软件为Western Blot条带定量分析设置ROI的操作方法、操作质控和验证的标准，Image J用户指南并无介绍。
       他山之石，可以攻玉。我们不烦先了解一下，Bio-Rad、Alapha和UVP等专业凝胶图像分析软件操作指南中，有关电泳凝胶图像和Western Blot条带分析选区ROI设置经验做法。

一、专业图像分析软件关于ROI创建的指导要求

1. 1 AlphaView Software-讲究松紧适度

       Alapha公司的AlphaView Software 在用户指南【Chapter 5:Image Analysis Tools 的Multiplex Band Analysis】指出，ROI边框要充分圈选全部待分析对象，实现“应检尽检”。

       采用“一带一景”（Local Background）“因区施策”法计算条带背景时，将选区中强度值最低的10个像素作为采样背景取其均值作为该条带背景值（Background region applied using the average of the 10 lowest pixels in a band region）。这就要求创建的ROI要略大于被检测条带（slightly larger than the bands），确保选框内有足够数量（不应低于10个）的条带背景像素，同时，避免引入过多背景像素和掺入邻近条带像素。

       正如AlphaView指南给出的object示范那样，ROI上、下、左、右四个方位选框内侧，都应该包含不低于1个像素宽度的背景。

1. 2 Bio-Rad Quantity One-力求完整包容

       Bio-Rad公司Quantity One在指南中对分析选区ROI创建要求是，绘制的选区要囊括全部含有数据信息的检测像素。针对背景不均匀的图像，采用Local background背景扣除法时，选框内应包含一圈1个像素宽但结构连续、完整的图像背景地带。选区最外围1圈像素强度值（intensities of the pixels in a 1-pixel border around the volume）之和除以边框像素总数（total number of border pixels）所得均值作为该选区的背景值。

       换句话说，如紧贴ROI选框的像素背景像素缺失或误入过多强悍的背景干扰像素，软件依然将外围一圈像素视作背景，据此产生背景强度将升高，必会造成检测信号损失而拉低选区的检测值。

1. 3 UVP LS Software-安内攘外并举

       UVP公司的LS Software的Define Area Density Background操作，其指南在【Define Background】中指出，在针对复杂不均匀的Western Blot条带图像进行Area Density分析时，软件默认每个ROI选区都会自动定义一个VIP专属背景（separate background）。这个用于自动计算图像背景值的选区，位于标记选区外，其宽为选区边框外紧邻的三个像素（three pixels wide），长为三个像素凑成的狭长环形区带的周长（the total of the perimeter around the region marked）。

       概括起来即，ROI内全部像素为检测目标像素，ROI选框外推三个像素的环形区域视为背景带。 

1. 4 小结

       以上调研表明，Bio-Rad、Alapha和UVP等知名凝胶图像分析软件在条带定量分析中，对分析选区ROI的设置规则有所不同。其区别的关键点在于，分析选区内是否需要引入图像的背景以及对背景像素范围的控制。

1）选区内背景分析法

       这种分析模式的代表是AlphaView Software和Bio-Rad公司的Quantity One软件。

       所建立ROI的最外围一圈须是背景像素，相当于采用有效像素区外延伸一圈像素，作为该条带背景的计算依据。

       此模式产生的选区背景的特征是：选区内所有像素均被扣除相同数量的背景值。其背景去除效果，类似于Photoshop的图像亮度整体调节功能。

       适用对象为：Western Blot实验图像上条带的背景均衡、均匀，且信号峰前、后均背景本底条件一致或十分接近。

2）选区外背景分析法

       以UVP品牌LS Software软件为代表的这种分析模式，分析选区内部全部视为有效信号像素，从选区边框向外延伸3圈像素宽度作为条带参考背景。

       这种模式产生的选区背景适用对象与前一种分析模式相同。

      与前一种选区设置要求的区别是，它采用ROI外部的3圈像素的均值计算背景，而前者是ROI内部最外围1圈像素作为背景。       

       现在的问题是，ImageJ软件在用于Western Blot条带定量分析过程中，ROI创建应该遵循什么规则？

       要回答这个问题，首先要了解ImageJ软件中ROI的特征。而观察和分析ROI，最直观有效的方法之一，就是下面要讨论的Plot Profile分析模块。

二、ImageJ软件Plot Profile分析模块功能特点
2.1 Plot Profile模块工作界面 

       在ImageJ软件中执行【Analyze】→【Plot Profile】命令，即可调出Plot Profile分析模块，显示直线选区（line selections）或矩形选区 (rectangular selections)的像素强度-水平距离关系二维图形。  

       X轴代表垂直方向像素列离开选区左侧边界的水平方向距离（distance/pixels），即水平方向跨越的像素数量（horizontal distance through the selection），用像素数表示。
       Y轴代表选区内垂直方向像素列的平均像素强度值（vertically averaged pixel intensity）。本示例为Western Blot暗底白带型效果图，列强度值为像素灰度值。

       对于矩形选区(rectangular selections)，当选区为2个像素或像素列时显示为斜线图；选区像素列达到3个像素显示为峰线曲线图。
       用矩形选区可选定当行像素显示单行或多行像素的峰线曲线走势图。在ImageJ软件为Western Blot实验条带创建分析选区ROI时，这个功能可用于预判断条带边界范围。

       当选区为1个像素列时，在窗口左下角显示的数值为该列像素的强度均值；

       当选区仅包含1个像素时，显示的是该像素灰度值。
       点击菜单中【Analyze】→【Measure】命令，在弹出的【Results】窗口中，显示的是黄色选框内从像素列0到像素列16在内全部像素的统计分析结果。

2.2 Plot Profile实时显示功能 

       点击Plot Profile窗口底部的Live按钮，字体可在红色-黑色之间随意切换。

       当Live呈现为红色字体状态时，当前活动图像窗口选区的调整变化，窗口的选区像素强度值峰线曲线图随之发生改变。这一功能，对于创建Western Blot条带分析选区ROI，具有特别重要的参考价值。

       此外，在后续对选区背景扣除条件设置方案的评估中，可实时预览不同背景扣除条件的去背景效果，有利于背景扣除条件的评估优化。 

三、运用ImageJ软件为Western Blot实验条带建立选区ROI的基本原理和规则 

3.1 用ImageJ软件为Western Blot条带建立分析选区的基本原理

       一般认为，CCD成像系统生成Western Blot图像强度信号，包含三种成份，即CCD成像芯片本身的电子噪音，来自实验样品（如转印PVDF膜、化学试剂和缓冲液的自发荧光）的光子信号和条带发光产生的检测光子信号。对在成像过程，CCD本底噪音电流效应、样品背景光学能量和连同条带释放的光学能量都被如实记录。CCD对感受电子信号不问出处，来者不拒，是无差别累积存储。因此，图像中的像素强度值是由图像背景、检测信号和CCD本底噪音三者相生相伴、相互叠加形成的。图像的背景与检测有效信号这两股势力之间，并非此消彼长的博弈和竞争的关系。
       而ImageJ软件的Plot Profile分析模块显示的图像信号分布-位置关系图中，任一像素列的强度数值，同样是背景-信号的综合值。
       众所周知，WB条带的蛋白含量有其特殊分布规律：沿着条带电泳方向，离开条带短轴中轴线越远，条带含量越低直至最终消失。因此，在图像短轴方向上，检测信号与背景信号叠加信号强度也相应响应衰减趋势。表现在Plot的图像信号强度分布图上，是信号分布曲线随着条带信号分布，呈现出低谷-峰值-衰减-低谷的规律性变化。
       依据图像某个区域信号强度曲线的显著变化，即可判定此处条带有效检测信号高低和有无，据此评估条带有效信号的分布范围。

3.2 用Plot Profile分析模块创建WB条带ROI的基本规则

       首先，重视利用Plot Profile模块分析功能，以图像信号曲线走势，指导研判条带有效信号分布范围；

       其次，Measure分析的是ROI内全部有效像素的分析统计值。因此，ROI须最大程度地囊括条带的全部有效信号像素，同时限制和尽量减少背景像素进入选区。ImageJ图像分析软件创建的分析选区ROI不仅不需要引入背景像素做参考，想法，还应避免框选代表图像背景的像素。这一点，与其他专业凝胶图像分析软件的选区设置规则，存在根本区别 。

       再次，ROI设置合理与否判定标准之一是，背景扣除后，ROI统计值中min值应为0。min值大于0，则需适度调整选区位置和范围，重新计算滚球半径。

       创建ROI的具体流程，可参考《如何用ImageJ为Western Blot条带定量建立分析选区》。

用参考文献

1. Bio-Rad Quantity One User Guide for Version 4.4

2. AlphaView Software User Guide_94-13934-00 Revision 3a (2011)

3. Life Science Software Installation and User Instructions (81-0254-01 Rev L)

4. ImageJ User Guide (IJ 1.46r)