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如何用ImageJ为Western Blot条带定量建立分析选区
让ImageJ在Western Blot图像分析中绽放-3
ImageJ软件用于Western Blot条带定量分析，首先要创建分析选区（ROI）。选区既是框定了被分析对象图像信号分布的范围，也等于设定了图像背景基线、确定了图像背景扣除的滚球半径。因此，科学合理的ROI创建，是条带分析数据客观有效、确保后续分析不偏离正常航向的灯塔。
为WB条带建立ROI操作，可分为4个基本步骤：图像准备，ROI边界范围评估，正式创建ROI和ROIs方案保存。
一、图像的准备
因Western Blot实验条件系统和操作者个人经验技术等因素，WB实验图像的条带位置排列难以整齐划一，往往倾斜，形如翘板，相互间参差不齐。
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来源：Scientific Reports(2018) 8:17121 | 来源： Cells 2020, 9, 80; doi:10.3390/cells9010080 | 来源： Nature Communications (https://doi.org/10.1038/s41467-020-19554-7) |
采用图像分析软件的旋转功能，有可能会对条带的图像分析结果产生偏差。这一点，有兴趣的读者可以参考《图像旋转操作对Western Blot条带定量分析影响的评估与对策》一文。因此，我们并不主张对WB原始条带图像滥用旋转校正功能。
将原图的副本保存为.Tif格式备用即可。若基于条带的图像灰度值进行分析统计，对于暗条亮底图像反相转换为亮条暗底型后保存。
二、ROI理论边界范围评估
打开待分析的Western Blot条带图像。
对于条带外形规则的WB条带，可首选方形选框(Rectangular Selection Tool)“圈地”，便于后续简单地移动后套用及随时自由地缩放ROI框选范围。
多边形选区工具(Polygon Selection Tool)、自由手绘工具(Freehand Selection Tool)，具有“因势利形”的优势，可用于“笑脸”形、“哑铃”形等不规则条带的圈选，便于“量身定制”去除背景像素。不足之处在于，这种ROI将无法调用Plot Profile功能模块。
WB条带分析选区ROI理论边界范围的评估，包括以下流程。
2.1 启动Plot Profile分析模块
点击主界面的【Analyze】→【Plot Profile】菜单命令，调出【Plot Profile】窗口并激活实时显示功能。
选择图像中条带亮度高同时边界清晰的一条下手。
2.2 建立ROI试验选区
从目标条带中选较“干净”的一小段，建立ROI “先行试验区”。
试验区的高度H，根据用《ImageJ创建Western Blot条带分析选区的基本规则》的介绍，采用1行或多行像素均可，视条带图像具体条件而定。初始宽度W，原则是力求总揽全局，便于整体预判。
判断条带有效信号覆盖范围，要依靠Plot Profile窗口的信号强度分布曲线图，从ROI试验区信号主峰的左右两翼外围曲线走势突然转平或向上折返为标志，判定为信号强度和组成变化的拐点。拐点试验区边界的临时红线，但并非选区的最终有效边界。
以像素列为单位，以左右两侧曲线的拐点为界，由两侧向中心把曲线覆盖区域依次分为背景区、缓冲区和理论检测信号区。左侧拐点曲线变化剧烈，通常可视为信号与背景临时分界线。右侧拐点附近曲线趋势平缓。蓝色区域曲线的走势，在后续随着ROI扩大，通常会因背景信号成份加入而进一步变缓，最终转变为背景区而被排除，故划为缓冲区。
据此初步判断，该条带位置位于x4 - x23区间，此范围即后续ROI的红线。
以下是实际工作中常见的条带信号分布曲线图的几种拐点标志。
实际实验图像中，一侧曲线边缘呈现双重拐点标志的情况，亦不罕见。这种情况下，应以离主峰最近的拐点计算红线。
ROI试验性评估步骤，对于强背景干扰条带、弱信号条带和像素不规律分布或/断裂型弱信号条带ROI创建中有效边界判定，具有重要指导意义。
三、在ROI试验区上扩展创建正式ROI
良好的开端是成功的一半。
而创建科学合理的Western Blot条带分析选区，对于分析数据的精准可靠所发挥的作用，恐怕要超过一半。
精确界定ROI范围，通常需要在ROI实验区的基础上，经历几个环节的精雕细琢，选区的创建才能趋于合理。
3.1 确认选区的高度
选区的高度，即条带长轴的长度。
保持即有ROI试验区的左右边界坐标不变、宽度不变，移动上、下边框，调整选区高度，直至选区足够覆盖比目视下条带上下边界即可。
当条带信号弱而背景强，条带间起止界限不容易肉眼判别时，可参考两个办法来确定：
1）图像旋转90°后，在Plot Profile窗口，矩形选框同时圈定2个相邻条带，从两个主峰之间曲线走势低谷，找出交界地点；
2）根据图像上条带最清晰的两个相邻条带各自长轴长度和条带间隔大小，判定其余条带的大致位置分布和长度。
不同条带的ROI高度，视实验和图像条件，可能存在1-4个像素的差异。
3.2 优化选区的宽度
选区精确界定是个精细的活。
通常，随着ROI试验区上下选框扩张，Plot Profile显示强度分布曲线主峰的两翼的曲线部分会发生明显改变：或变得更平缓或出现新的拐点。此时，应进一步收窄ROI范围到新拐点。但接下来有2个细节，是需要妥善处置的。
3.2.1在Plot图上精确判定条带有效信号分布边界
先看一幅图，有助于对ROI创建规则有更深入清晰的概念。用柱状图高度代表像素列强度，Plot Profile相当于将每列像素的柱顶连接形成常见Plot曲线图。图中框选了21列像素，对应的水平坐标值分别标示为0-20。
根据曲线图主峰两翼末端外围1-2列像素强度值曲线，评估目前选区范围图像背景强度水平（如图中的虚线所示）。将强度高于背景水平线的像素列视为有效信号。
此时可初步认定，选区信号分布范围介于3-17号像素列。
观察发现：此时确定的选区范围，相当于从拐点出发左右各缩进一列像素后范围。这正是本文前面提到的，拐点只能作为选区的初始红线而不能以曲线拐点作为边界的道理。
3.2.2 结合图像上条带的结构特点优化选区
在选区创建中，Plot Profile只能算老司机的车载导航仪。由于曲线依据像素列的强度均值而呈现，但并没有区分背景和信号组成比例的功能。完全依赖Plot图设定ROI，轻则夸大选区分析值，重则误导分析结论。
实际操作中，还要综合条带图像边缘部分像素列结构的完整性、图像周围背景分布，才能有效确认条带选区边界。
通常，条带边缘像素列的断裂痕迹是可靠的定位参考标志物。
如图所示，所谓的像素列断痕，就是用绿、橙、红色标示的像素。这些像素信号由于自身强度剧减，使具有相同水平坐标的像素群组成的像素列表现出纵向“断裂的痕迹”。
其中靠条带内侧的绿色“断裂带”夹杂明显有效信号像素，橙色断裂带则无肉眼可充分辨识的有效信号像素，但未见背景像素。而红色“断裂带”中则可见为数不少的背景像素。
通常，判定ROI是否符合IiamgeJ软件分析要求，以下两条建议可以参考。
1）条带选区两侧的边缘，不应包含肉眼可直观判识的背景像素。
在遇见条带边缘的某个弱信号像素列，到底应算作有效信号还是视为背景须从选区排除而难以取舍时，可以该列像素是否包含背景像素作为划分标准和底限。
2）合格ROI选区的Plot Profile曲线特征是：信号主峰两翼末段的曲线，应以一定斜率“接地”或呈向下倾斜态势。
如末段呈现上样或水平状态，有悖于WB条带信号分布一般规律，应予调整。
ROI设置完成后，点击鼠标右键，在弹出菜单中点击“Add to ROI Manager”，系统自动弹出ROI Manager面板。
为便于管理和记忆，ROI的数字名称可用Rename命令更名。
四、ROIs方案保存和管理
4.1 ROIs保存
为便于进一步分析和资料整理，避免每次花费大量精力重建选区，全部条带完成ROI创建后，在ROI Manager窗口确认【show all】激活和全部ROI呈现在图像上后，点击软件File菜单，软件的Overlay功能将ROIs信息叠加在图像上。
选择一个便于管理记忆名称，以Tif格式保存图像操作结果。
需要注意的是，无论是网络版还是脱机版，ImageJ软件默认保存路径是windows系统下默认的下载文件夹。下次原路径下打开图像后，已经创建完的ROIs会自动呈现，并可进一步编辑和分析。
4.2 ROIs设置的复制转移
创建的ROIs设置可以被复制套用到新的空白图像中。方法是：
A.打开已创建ROIs设置并保存的图像；
B.激活ROI创建工具中的方形选框，依次点击激活每个ROI。此时，ROI黄色边框转换为带调节按钮的形式，执行Add to ROI Manager操作；
C.打开相同规格的新图像后（要求两幅图像尺寸一致，同时条带形状、位置及大小一致），点击ROI Manager中【show all】或同时勾选【labels】选项后，上一幅图的ROIs设置将在新图像中精确再现。
当打开多幅图像后，只有其中一幅图像处于激活状态。点击要分析的一张图，则另一张图将自动退出激活模式。通过简单鼠标点击切换，可随时分析两幅图中ROIs。
D.把需要对比的两个不同ROI分别激活，分别执行Measure→Plot profile命令，可同时显示两个ROI的峰形图。
分别执行Measure，可调出共同Results窗口，计算结果按激活顺序显示在同一个窗口，便于比对分析。该功能适用于同批次实验中不同图像之间的比较。
参考文献
1. ImageJ User Guide (IJ 1.46r)
2. ImageJ创建Western Blot条带分析选区的基本规则
