在Western Blot条带定量分析中图像灰度值的应用实测-下

 让ImageJ在Western Blot图像分析中绽放-1

3 讨论部分

3.1 专业电泳凝胶图像分析软件指南有关图像数据值的说法

       调查发现，部分专业电泳凝胶图像分析软件用户指南中，内容设计上存在某些疏忽，的确容易引起初学者误解和概念的混淆。
3.1.1 Bio-Rad公司的用户指南
       伯乐Quantity One User Guide^［1］文件有众多示例图，均没有注明图片类型和来源，测试值均标示为光密度值。如：
       【5.3 Identifying and Editing Individual Bands】图Fig. 5-7，条带峰值显示为Optical Density；
       【5.7 Gauss-Modeling Bands】图Fig. 5-13，图像背景指标值为Uncalib. Optical Density；
       【10.1 Report Window】中图Fig. 10-2 Example of a report window的protein report，采用Peak OD、Average OD测试值。
       这些现象，使人们容易产生protein-OD值关联的直觉。

        但实情是，Quantity One用intensity of the pixels指代电泳条带、凝胶的背景测试值，文件【10.6 Volume Analysis Report】和【4.1.e Lane Profile】两处皆是。
       此后发布的Image Lab Software User Guide^［2］文件，这方面就改进了。

       【Chapter 3 Image Lab Software Overview】一节明确指出：
       Main Window状态显示栏显示的测试值分为intensity (Int)和optical density (OD)两种，数字范围为0–65535 (16比特) 或0.0–4.0 (OD)。
       可见，Image Lab Software User Guide对图像灰度值与光密度的概念是有严格区分的。

      
3.1.2 美国Alpha公司发布的指南文件
       AlphaView Software User Guide^［3］中Multiplex Band Analysis】、【Lane Profile】、【Analyzing Arrays】和【Measuring Density】等多个章节中多次采用含有density一词的表述。譬如，density of bands，density value，Measuring Density，pixel density等。望文生义容易给人误觉，以为指代测试值用的密度（Density）正是光密度（Optical Density）的略称。
       其实，该指南在【Contrast Adjustments】 、【Appendix B: Data Description Tables】等处明确测试值为图像灰度值pixel gray levels。在【Histogram】 一节专门对图像灰度gray levels做了科普性阐述。

       除density，指南还使用pixel intensity指代图像测试值。
       这说明，Alpha公司指南中，电泳条带分析中对于图像灰度值和光密度值概念使用是很明确的。

3.1.3 UVP公司《LS Software User Guide》
UVP的《LS Software User Guide》 ^［4］在“通则”部分用intensity指代测试值。
       gray levels仅出现在【Image Acquisition】一节，而density则见诸于【Area Density Analysis】和【Estimate Region Volume】两个模块有关篇幅。
       但须指出，该指南在【Perform Area Density Analysis】中【Area Density Results Definitions: "Density List" Tab】中指出，ROI测试值Total Density/Intensity分两种，即灰度值（Grey-Levels，GL) 或光密度值（Optical Density，OD)。具体测试值的选择须依Intensity Calibration curve校准类型而定。
       可喜的是，该指南还对Optical Density、Grey Levels两种实验图像测试值的适用对象做了明确规定。实质内容与ImageJ用户指南^［5］一致。

       归纳起来，专业凝胶图像分析厂家的技术指南文件中，图像强度分析数值分为图像灰度值（GL) 和光密度值（OD)两种，二者可统一用density（密度）或Intensity（强度）指代。

       density并非专指Optical Density（光密度值，OD），要视具体分析的图像类型而定。蛋白考马斯亮蓝染色凝胶、银染凝胶图像和Western Blot实验中ECL法检测原始图像，分析所用的图像强度值涵义是不一样的。因此，不可离开具体图像类型，把光密度（Optical Density)与密度（density）混为一谈，更不能把所有电泳凝胶有关的图像分析，不加区分二简单地冠以图像光密度或者图像灰度值。

3.2 Western Blot条带蛋白定量分析中图像强度值概念问题

       关于OD值和GL值的概念和运用，可参考《光密度值和灰度值如何在Western Blot条带定量和凝胶图像分析中应用?》一文。简而言之，就Western Blot实验图像分析应用而言，可以总结为以下3个要点。
       1）光密度Optical Density或密度density：可用于指代经典放射性自显影成像技术获得的胶片、胶片经透射型扫描仪扫描获得的亮底暗带型图像的强度值；
       2）目前普遍使用的ECL发光检测功能Western Blot印迹成像分析系统，其采集的亮带暗背景原始图像经反相处理为亮底暗条带型仿底片图像强度值，用光密度Optical Density指代是对的；
       3）放射性自显影曝光后冲洗所得的暗底白条带照片图像，还是ECL印迹成像系统采集的暗底白条带原始图像，应用“灰度（Grey-Levels)”或“密度density”值指代图像强度值。
       

3.3 图像灰度值应用于Western Blot条带定量分析的可行性

       本次实测的图像源自伯乐ChemiDoc MP Western荧光化学发光凝胶成像系统采集，但参考业界发文习惯做法，原图已处理为亮底暗条带的仿底片图像。基于3.2的讨论，须将发表图像再次反相处理，以还原为ChemiDoc MP系统采集的原图效果，方可用于图像灰度值分析。

       依托条带创建ROI取得像素灰度值散点曲线图和指数型趋势线，显示高度相关（R²＞0.998），并且该趋势线与电泳时蛋白初始载量归一化数据的趋势线（R²＞0.999）轨迹高度一致。趋势线指数方程的各指数常数高度接近，表明从图像逆向分析，通过分析图像灰度值数据，非常成功地再现了蛋白电泳初始载量数量对比关系。

       提示：在Western Blot实验中，直接采用ECL化学发光成像平台采集的暗底白带原图，基于图像灰度值指标进行分析，合理且可行。

      结合其他多次类似图像的实测结果（未总结发布），足以验证ImageJ等专业图像分析软件的指南对Western Blot ECL化学发光图像分析数值类型选择指导意见的正确性。 

3.4 总结

       Western Blot实验由于早期使用的是放射性自显影成像检测技术，图像曝光后的底片图像为白底暗带形式。而目前，采用CCD-化学发光成像检测技术已大行其道。但WB实验结果发表时，为照顾业已约定成俗、根深蒂固的“审黑”习惯，依然采用仿自显影底片图像。

       假作真时真亦假。把未经反相处理的原图本色发表，反而显得违和感太强，变成了一种错误的“正确”。

       在正式发文中，在描述图像强度值时，如有必要，采用的是图像灰度还是光密度值进行的分析，措辞须份外留神。不可正对仿底片型图像大谈图像灰度值分析，以致铸成高水平论文中“图片使用不当”的“院士级”错误！

      基于图像灰度值分析反向再现Western Blot条带蛋白初始载量精确数量关系的实测结果说明，基于化学发光CCD成像分析系统采集的原图灰度值数据直接进行蛋白条带定量分析的方法，技术原理上合理，操作上靠谱，结果上完全可以达到分析目的。

     实测中屡战屡被的经历告诉我们，Western Blot实验图像均存在复杂、不均匀、干扰背景偏高的现实条件下，用ImageJ软件对图像定量分析，从ROI创建到选区背景扣除的全过程是一个极具挑战的过程。

       感悟就是：ROI合理设置是基础，背景扣除设置条件的有效是关键。

       关于如何在WB条带定量中设置好分析选区的具体操作技术问题，可参考阿拉斯科技(www.alifescience.com)《百家论坛》栏目发表的《ImageJ创建Western Blot条带定量分析选区的基本规则》和《如何用ImageJ为Western Blot条带定量建立分析选区》等文章。

参考文献

1. Bio-Rad Quantity One User Guide for Version 4.4

2. Bio-Rad Image Lab Software User Guide Version 6.1

3. AlphaView Software User Guide_94-13934-00 Revision 3a (2011)

4. Life Science Software Installation and User Instructions (81-0254-01 Rev L)

5. ImageJ User Guide (IJ 1.46r)

6. Bulletin 6305：Clarity and Clarity Max Western ECL Substrates, Ver. D