在Western Blot条带定量分析中图像灰度值的应用实测-上

   让ImageJ在Western Blot图像分析中绽放-1

      《光密度值和灰度值如何在Western Blot条带定量和凝胶图像分析中应用？》提到了灰度值在图像中的涵义和在Western Blot条带蛋白定量分析中的适用问题。

       本文采用美国伯乐公司公开发表实验资料Bulletin，基于图像灰度值分析法，按ImageJ 1.46R操作指南，对实验图像进行分析回溯，用从图像分析取得的数据构建标准曲线，重构各检测条带蛋白含量对比关系。通过与公开实验数据曲线间的对比，评估图像分析数据对实验资料披露数据的再现、还原程度，探究图像灰度值数据用于Western Blot条带定量分析的操作流程、方法创建过程，同时检验该分析方法在蛋白免疫印迹检测分析中应用的可行性。

1 材料和方法

1.1 图像来源及基础工作准备

      原图引自《Bulletin 6305：Clarity and Clarity Max Western ECL Substrates》(Ver D)中“Fig. 3. Comparison of chemiluminescent substrate signal intensity”一节中Clarity Max测试组实验结果的.bmp格式图像。

      蛋白电泳实验：纯化IKBα，上样量700pg (band 1)，470pg (band 2)，310pg (band 3)，210pg (band 4)，140pg (band 5)，90pg (band 6)，60pg (band 7)，40pg (band 8)，30pg (band 9)；Western Blot化学发光底物为Clarity Max Western ECL Substrates（Bio-Rad）;SDS-PAGE电泳采用Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra Cell小型蛋白垂直电泳系统、电转印采用Trans-Blot Turbo 快速蛋白转印仪、免疫印迹分析检测平台为Bio-Rad ChemiDoc Western化学发光凝胶成像系统，曝光时间70秒。

      将图像用Adobe Photoshop 13.0.1简体中文版执行“图像-调整-反相”操作（也可用Win 7的“附件-画图”工具进行反相处理），“技术还原”为基于CCD原理的ECL免疫印迹成像系统采集到图像的本来面目（CLIA-style）后，将图像保存为.tif格式备用。

1.2分析软件

       ImageJ 1.53g（Java 1.8.0-internal，32-bit，http://cnij.imjoy.io/）；

       操作系统win 7旗舰版(32位)，Google Chrome 浏览器，MS office 2010 Plus(32位)。

1.3图像灰度值法分析操作

1.3.1 图像分析前的调整

        启动网页版ImageJ 1.53g后，打开图像文件CLIA-style.tif。

        启用Image→Transferm→Rotate 90 Degrees Right命令，将图像顺时针旋转90°。

1.3.2 建立ROI

       采用方形工具，依次框选9个条带，建立9个ROIs并添加到ROI Manager（ROI管理工具）中。

       测试中以图像中各条带为对象(Object)创建的ROI，详情如下。

Table 1  Area and XY coordinates of the ROIs

       Western Blot实验图像各条带分析选区创建方法，可参考《如何用ImageJ为Western Blot条带定量建立分析选区》等文章。

1.3.3背景扣除方法的创建

       在Process→Subtract Background下拉菜单中调出Subtract Background对话框，设定背景扣除滚动圆球半径（Rolling ball radius），并根据各条带周围背景情况不同，勾选平滑抛物线(Sliding paraboloid，SM)、禁用smoothing算法计算背景（Disable smoothing，DSM）选项。

       由于所选Clarity Max Western ECL 底物标记组图像的背景本底不均匀，且存在大面积、强干扰区域，故采用“一带一景”策略。在对所有选区评估基础上，对各选区分别采用优化背景扣除实施方案。本测试设定的背景扣除算法详情见表2（在Western Blot条带定量分析的背景扣除中如何计算滚球半径、如何进行条件设置和优化的问题另行讨论，可参考《用Rolling ball为Western Blot条带分析背景扣除牛转乾坤》、《Western Blot条带分析中如何计算ImageJ的滚球半径？》及《Western Blot条带分析中如何设置ImageJ的背景扣除选项》等有关文章）。

Table 2  Subtract Background Command Setting of the ROIs

1.3.4 分析参数设定

       在Analyze→Set Measurements下拉菜单中调出Set Measurement勾选Area（选区），Min & max gray level（选区内像素最小灰度值和最大灰度值），Mean gray value（选区平均灰度值），Integrated density（选区积分密度值/积分强度值）；Decimal places（检测结果保留到小数点后位数）选0。

1.3.6 测定和保存

       在ROI Manager中左边选中目标ROI，点击右侧的Measure。将弹出Results窗口，显示上一步选定参数的计算结果。

       点击Results弹窗中的File菜单，软件默认保存路径和文件名为【C：\user\当前用户\下载\Results.csv】,文件名可以自行命名。

       以band-1选区IntDen测试值为基准，将其他band 1～band 8的强度值与band-1值的比值作“归一化”处理。

       同时，按相同办法，计算各带原始蛋白上样量比值。

       最后，将各选区IntDen值比值与各条带蛋白载量比值分别绘制标准曲线，添加曲线的趋势线和趋势线指数方程。

2 结果

2.1条带灰度值法测试计算结果

Table 3  Results of CLIA-style

       Table 3显示，采用Western Blot 免疫印迹ECL化学发光图像分析系统采集的黑底图像获得的选区灰度积分值比值与对应条带的原始蛋白上样量比值存在高度关联。

       根据Table 3绘制的选区灰度值比值和蛋白上样量比值标准曲线图如下所示。

       Western Blot条带图像测试值与蛋白载量标准曲线图

       图像散点曲线图显示：根据各条带选区的灰度积分值归一化数据构建的指数趋势线轨迹，与依托蛋白初始上样量数据曲线的趋势线，轨迹存在高度吻合，两个趋势线方程的常数值高度接近，且各方程与趋势线存在高度关显著（R2＞0.998）（未完待续）。