浅析低密度探针阵列TaqMan Array Card在生物医学实验中的应用-中

应用驱动型qPCR仪选型攻略-9 

三、如何设计TaqMan Array Card的布局方案 

       TaqMan 阵列卡分为库存TAC（Inventoried TaqMan Array Card）和定制型TAC（Custom TaqMan Array Card）两类。 

       库存TAC针对特定应用在卡上已包被有12-381个测定靶标的TaqMan探针和引物组，无需用户设计靶标排布，可以直接使用获得高度可重复的结果。库存TAC有胃肠道感染病原体检测TAC、呼吸道感染病原体检测TAC、基因表达研究TAC、miRNA研究TAC等。 

       定制型TAC，顾名思义，实验者须根据实验要求确定检测靶标种类、数量、单个靶标的技术重复数和阳性对照靶标设置，确定TAC上靶标阵列分布图。TAC样品技术重复有重复1次(singlet/no replicates)、2次(duplicates)、3次 (triplicates)和4次(quadruplicates)可选。同一靶标技术重复孔内的引物-探针组成分完全一致。 

       我们先来了解一下ABI库存的标准化TAC阵列排布设置原理。 

1）Format 16、Format 32和Format 64三款TAC，每个样品的每种靶标为3次技术重复。

       Format 16 TAC示意图中，左右两列蓝色数字分别8个上样通道。16代表该款TAC可检测靶标的种数共16种。

       由于检测数据质控和数据分析归一化要求，每张卡必须至少预留一个强制性地内参对照靶标（Mandatory Manufacturing Control），这样Format 16实际可测靶标种数为15个（Target Assays）。Format 16卡上每个靶标3个复孔，16×3=48孔，所需反应孔数刚好占满一个通道48孔。整张卡可测试8个不同样品。

2）Format 32 TAC，用于测试1个对照靶标+31个测试靶标，每种靶标3次技术重复，所需反应孔数为32×3=96个，一个样品需占用2个检测通道（即2×48孔），每张卡只能测试4个样品。

3）Format 64卡，用于测试1个对照靶标+63个测试靶标，每种靶标设3个复孔，所需反应孔总数为64×4=192个，一个样品占用4个检测通道（4×48孔，即图中Port 1-4），每张卡只能测2个样品，样品通量为Format 32卡的一半。

       要提高检测效率并降低成本，最直接办法是把技术重复数量降低。

       如Format 24，每个样品可测试靶标种数达到23种，每种靶标2个技术重复，每张TAC可测试8个样品。4342249货号一个包装可满足80个动物测试。如需筛选的靶标种数多达数十甚至上百种，为便于后期数据分析，采用Format 48、Format 96a、Format 384 卡，一个靶点一个孔，或用2-3块板来完成技术重复，无疑十分便利。

       基于以上TAC阵列排布规律和特点，我们来看2个两个实例。一个Human Inflammation Array (P/N 4378707) 库存TAC，一个定制TAC。 

        Human Inflammation Array卡上共96种靶标（其中18S为对照），每个样品占用2个上样通道，相当于Format 96a的布局（每靶标4个技术重复）。

        TaqMan Array Card for 19 Enteropathogens即本文提到的美国弗吉尼亚大学开发的肠道病原体检测TAC，是学术界TAC网红。 

       该TAC可测试靶标种数共24种，理论上可以实现每个靶点2个技术重复，相当于Format 24。但实际上，它可检测19种常见肠道病原体的23种靶标，其中15种病原体为单靶点检测，另4种病原体为双靶点检测。 

       它的对照设置有特点：质控对照18S、临床样本阳性对照16S均为singlet；采用了Combined positive controls对照，是针对病毒、细菌靶点分别设置了DNA、RNA阳性对照。 

       技术重复设置上与标准格式有区别：病原体中Norovirus GII、C. difficile、Trichuris、Ascaris、STEC stx1和STEC stx2用的是singlet，其余病原体靶点统一为2个技术重复（并非常规qPCR中同一个样品三个复孔法）。 

       再如啮齿动物TaqMan Array MicroRNA A+B Card，每张TAC包含384个TaqMan MicroRNA分析，能在5小时内完成的641个microRNA测定。每个阵列包括三个物种内源性对照及一个与啮齿动物无关的TaqMan MicroRNA靶点作为阴性对照。 

       上述两个TAC案例提示我们：不同应用类型、不同样品，对照靶标设置要求不完全一致。技术重复的多少、对照的设置因实验目的和样品异，是实验者需要斟酌的，事关数据可靠性和TAC靶位阵列整体布局安排。 

（待续）