浅析低密度探针阵列TaqMan Array Card在生物医学实验中的应用-下

应用驱动型qPCR仪选型攻略-9

四、TaqMan Array Card运行所需配套条件 

       TAC检测本质上依然是TaqMan探针实时荧光定量PCR反应，只是反应承载介质不同。在操作流程中，核酸提纯、反应条件设定及数据分析并无二致。区别首先是上文所议的TAC阵列布局设计，其次是点样后的TAC处理环节。 

       简单地说，TAC上机运行前，须完成以下5步操作： 

1） 上样 

       移液枪头吸取100 µL配好的PCR反应液（含TaqMan Universal PCR Master Mix和模板）注入TAC加样孔（Fill port）。

2） 离心 

       将已上样的TAC插入特制的TAC适配器（Card holder）中，加样孔在上，反应孔朝向适配器有标记的一面。将适配器插入离心机水平转头吊篮，转速1200rpm(相对离心力331×g)离心两次，每次1分钟。 

3） 密封 

       将完成离心的TAC放入专用封片机TAC Sealer，手工完成密封。 

4） 实时荧光定量PCR仪运行反应模块设置 

       TAC与其它常规96/384孔反应板模块，在仪器设置上有区别。 

       实验前须确认仪器已安装TaqMan Array Card反应模块。然后在仪器设置环节选择 “384 Wells TaqMan Low Density Array”或“TaqMan Array Card ”或“TLDA”。 

       正确选定反应模块后，还需导入TAC样品靶点设置信息对应的SDS Setup文件（SDS Setup文件包含了TAC反应孔靶位排列设置信息。文件可以被直接导入软件），完成反应板的设置（相当于常规qPCR的plate setup操作）。 

5） 按仪器使用说明完成其它设置，运行实验并分析实验数据。 

       上述操作流程中，须有以下配置要素支持，这是前提。 

4.1 配置TAC模块的实时荧光定量PCR仪 

       综合目前Applied Biosystems一系列技术文件，确认以下Real-Time PCR System可用于TAC检测，包括： 

       7900HT Fast实时荧光定量PCR系统； 

       ViiA 7实时荧光定量PCR系统： ViiA 7 Real-Time PCR System with TAC block（4453537）、ViiA 7 Dx（临床诊断型）； 

       QuantStudio 7 Pro实时荧光定量PCR系统：QuantStudio 7 Pro Real-Time PCR System with TAC block（A43186、A43165）； 

       QuantStudio 7 Flex实时荧光定量PCR系统：QuantStudio 7 Flex with TAC block(4485700、4485696)； 

       QuantStudio 12K Flex实时荧光定量PCR系统：QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System with TAC block(4471089)；

       QuantStudio Dx实时荧光定量PCR系统； 

       TAC专用反应模块（TaqMan Array Card Block，TAC sample block）工作套件包括TAC模块热盖（384-Well/Array Card Heated Cover）、TAC模块基座(Array Card Sample Block)和TAC模块适配器（Array Card Adapter)三个部件。因不同机型安装接口不完全一致，适用的TAC反应模块不完全兼容。 

       上述机型若未选配TAC Block，则需添加相应TAC升级包才能实现TAC检测功能，详情见表2。 

表2 Applied Biosystems实时荧光定量PCR仪TAC专用升级包

         升级包中配置了一个TAC样品模块, 一个TAC专用密封器（TaqMan Array Card sealer）和TAC离心专用套件（Array Card Bucket/Clip Set）。TAC离心套件须在满足特定配置要求的离心机才能运行。

          目前，除赛默飞TX-750水平转头外，eppendorf公司为5920R大容量台式离心机开发了两种TAC离心专用适配器。5920749005型适配器（2个/套）适用于S-4xUniversal-Large水平转子套件（5895190006）；5825759001则需在S-4x1000转子吊篮套件（5895118003）中使用。每个适配器同样可固定3块TAC板，4个适配器同时使用最多可离心12块TAC。

4.2 专用离心机和配套转头 

       ABI为TAC离心所定制的套件包括Array Card Centrifuge Bucket 75015679和Array Card Holders 75015686（即Array Card Clip或Array Card Adapter），介绍此处从略，可点击链接了解详情。 

       据2021版官方资料，TAC离心套件是依托4×750mL水平转头TX-750(75003180)、TTH-750(75006445/75006434)开发的。它适用于以下型号赛默飞离心机： 

       Multifuge X4 Pro、Multifuge X4R Pro高通量高速低温离心机 

       Sorvall ST4 Plus、Sorvall ST4R Plus高通量低温离心机 

       Megafuge ST4 Plus、Megafuge ST4R Plus台式大容量离心机 

       Sorvall X4 Pro、Sorvall X4R Pro台式高通量离心机 

       Megafuge 40、Megafuge 40R台式大容量高速冷冻离心机 

       Multifuge X3、Multifuge X3R台式大容量高速冷冻离心机 

       Sorvall ST 40R台式低温高速离心机 

       Sorvall Legend XT、Sorvall Legend XTR低温高速离心机 

       Sorvall Legend T Plus、Sorvall Legend RT Plus低温高速离心机 

       SL40、SL40R台式大容量高速冷冻离心机 

       官方技术指南要求的TAC最大离心转速 1200rpm，与此对应最大相对离心力rcf 为331×g,离心2次，每次离心1分钟，并确保转速控制在指定范围。 

       国内外部分文章中把离心转速/离心力写成12000xg或1200xg，显然有误。

五、关于TaqMan Array Card方法应用的几点共识 

1）门庭冷落车马稀 

       TAC检测的高时效性、高通量性、高可靠性和高稳定性表现，已被近20年来临床、医学、生物学研实践所证明。然而PubMed数据显示， [Text Word]为检索范围，2006年1月-2022年2月，所有与TAC应用有关的论文总数仅区区1745篇。 

       另一方面，在ABI ViiA7上市前的2004-2010年，单依托7900HT Fast 实时荧光定量PCR系统发表实验论文就多达4538篇。说明：在7900HT Fast用户中，仅有不到40%的实验室开展了TAC实验。从TAC上市至今，其公开发表的应用案例数量（注：核查后实际数量比PubMed检索的条目数少），与基于7900HT Fast、ViiA 7、QuantStudio 12K Flex、QuantStudio 7 Flex、QuantStudio 7 Pro系列实时荧光定量PCR仪开展Taqman探针实验的论文基数比，简直可以忽略。 

       委实一派曲高和寡、叫好不卖座的惨象。 

2） 梅须逊雪三分白,雪却输梅一段香 

       澳大利亚莫纳什大学科研人员，用TAC和常规qPCR方法完成了一项对墨尔本市政废水及斐济籍定居者定居点人、动物和环境样本中病原体的流行病学调查。在2021年5月Lancet Planet Health（IF19.17）的刊文中，对TAC方法与标准qPCR法的测试表现做了评价。对于添加基因片段的不含PCR抑制剂的样本基质，两种检测方法的特异性 (TAC 100%，qPCR 94%)、敏感性(TAC 92%，qPCR 100%)和定量准确性(TAC 91%，qPCR 99%)相似。对取自实际居住点环境样品中的8个肠道病原体靶点检测，两种技术定量结果一致性为89%。常规qPCR方法在检测敏感性、准确性和耐受样本中PCR抑制剂干扰能力更胜一筹。 

       事实上，国内外众多刊文都提到，TAC检测灵敏度、LOD性能指标不及常TaqMan探针荧光定量法,对核酸样品纯度和品质要求极严。因此，靶点丰度濒临TAC的LOD的测试样品，极有可能出现摸棱两可或假阴性结果。
       TAC方法的长项在于一石多鸟，快刀斩乱麻。该方法有利于人们在弥天大雾中，快速确定方向、缩小搜索范围并锁定目标。因此，可极大降低实验人力和时间耗费，加快探索进程，这是其核心价值。

3） 北畔是山南畔海，只堪图画不堪行 

       Lancet Planet Health一文中“Table 3: Comparison of TAC and qPCR for monitoring multiple pathogens”所提供的TAC实验成本测算数据显示：常规qPCR法检测中，每种靶标不设重复情况下，试剂成本约为2.10美元。样品数量增加所致试剂开支增加很少。但若靶标设置为2个技术重复，则人工和试剂成本翻倍。而TAC测试，每个样品的试剂成本约60美元，分摊到每个靶标后，试剂成本约1.28美元。 

       2020年，有国内学者指出：TAC单孔检测成本约是普通PCR板介质qPCR实验的8倍。 

       若以Format 24型Custom Gene Expression TaqMan Array Card（4342249）来估算，每个靶标设置2个重复、测试23个靶基因表达水平，不计前期mRNA提取纯化、cDNA反转录、PCR预混液准备环节试剂开支，单是TAC定制成本就2.8万元，折合每张TAC造价近2800元以上。再加上样品准备阶段TaqMan 2× Universal PCR master mix、RNA-to-cDNA反转录等必须试剂开支，每个样品测试成本得超350元，这个价与国外报道的结论吻合。

参考文献

［1］ Jie Liu, Jean Gratz, Caroline Amour, et al. A laboratory-developed TaqMan array card for simultaneous detection of 19 enteropathogens. Journal of Clinical Microbiology, 2013,51(2):472-480.
［2］Maja Kodani, Genyan Yang, Laura M. Conklin,et al. Application of TaqMan low-density arrays for simultaneous detection of multiple respiratory pathogens.J Clin Microbiol. 2011 Jun;49(6):2175-82.
［3］Jie Liu, James A Platts-Mills, Jane Juma,et al.Use of quantitative molecular diagnostic methods to identify causes of diarrhoea in children: a reanalysis of the GEMS case-control study. Lancet. 2016 Sep 24; 388(10051): 1291–1301.
［4］Martha S. Windrem, Mikhail Osipovitch, Zhengshan Liu, et al. Human iPSC glial mouse chimeras reveal glial contributions to schizophrenia. Cell Stem Cell. 2017 Aug 3; 21(2): 195–208.e6.
［5］Victoria Honnell, Jackie L. Norrie, Anand G. Patel, et al.Identification of a modular super-enhancer in murine retinal development. Nat Commun. 2022; 13: 253.
［6］Thomas Rio Frio, Amin Bahubeshi, Chryssa Kanellopoulou, et al. DICER1 mutations in Familial Multi-Nodular Goiter with and without Ovarian Sertoli-Leydig Cell Tumors. JAMA. 2011 Jan 5; 305(1): 68–77.
［7］Tomas Smutny, Jan Dusek, Lucie Hyrsova, et al. The 3-untranslated region contributes to the pregnane X receptor (PXR) expression down-regulation by PXR ligands and up-regulation by glucocorticoids. Acta Pharm Sin B. 2020 Jan; 10(1): 136–152.
［8］Cynthia L. Bethea, Arubala P. Reddy. Ovarian steroids regulate gene expression related to DNA repair and neurodegenerative diseases in serotonin neurons of macaques. Mol Psychiatry. 2015 Dec; 20(12): 1565–1578.
［9］Stephen Y. Chan, Ying-Yi Zhang, Craig Hemann, et al. MicroRNA-210 Controls Mitochondrial Metabolism during Hypoxia by Repressing the Iron-Sulfur Cluster Assembly Proteins ISCU1/2. Cell Metab. 2009 Oct; 10(4): 273–284.
［10］TaqMan Array Card简明中文手册（MAN0026018 Rev. A修订版）
［11］TaqMan Gene Expression Assays TaqMan Array Cards User Guide(4400263 Rev. G)
［12］TaqMan Array Cards Product Bulletin TaqMan Array Cards（COL1140540521）
［13］Rachael Lappan, Rebekah Henry, Steven L Chown, et al. Monitoring of diverse enteric pathogens across environmental and host reservoirs with TaqMan array cards and standard qPCR: a methodological comparison study. Lancet Planet Health. 2021 May; 5(5): e297–e308.
［14］徐君怡, 曹际娟, 郑秋月, 等. 基于Taqman微流控芯片技术高通量检测17种转基因玉米品系. 分析化学, 2020, 48(11): 1477-1485.
［15］虞惠贞，侯寒黎，尹文秀，等. 利用TaqMan微流控阵列同步检测多种动物源性成分.浙江大学学报（农业与生命科学版）,2020,46（2）：189-200
［16］ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System Specification Sheet (2003/09)