浅析低密度探针阵列TaqMan Array Card在生物医学实验中的应用-上

应用驱动型qPCR仪选型攻略-9

一、TaqMan Array Card的工作特点

       TaqMan探针低密度阵列(TaqMan low-density array，TLDA)，即TaqMan探针阵列卡(TaqMan Array Card，TAC)，是依托5’-端核酸酶水解原理TaqMan探针和实时定量PCR仪这一技术平台、采用特殊生产工艺和结构制成的384孔检测板（为方便表述，下文统一使用TAC简称）。

       TAC于2003年9月随ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System一同推出，主要用于高通量基因表达的定量分析。最早被命名为TaqMan Array Micro Fluidic Card（微流体芯片）。目前的赛默飞官方文件和国外刊文中，已很少使用Micro Fluidic Card的名称。检索2006年1月-2022年2月发表的TAC应用论文发现， PubMed库中“PCR[Text Word] AND TaqMan low-density array[Text Word]”可查到1292条记录，“PCR[Text Word] AND TaqMan array card[Text Word]”为453条记录。“TaqMan Array Micro Fluidic Card[Text Word]”则仅1篇文章(因“方法”的同一段落同时用了TaqMan Low Density Array card 、TaqMan Array Micro Fluidic Card两种表述)，而“TaqMan Array Microfluidic Card[Text Word]”则查无记录。

       其实，TAC与微流控芯片（Integrated fluid circuit），从结构设计到工作液体控制原理都有区别。一般意义上的微流控芯片多具有复杂流路结构，测试所需液体需由微量蠕动泵和微量控制阀控制和输送到反应微阵列单元。而TAC的液体流动和分配则是通过人工简单离心操作，借助于离心力作用来实现每个样品通道所辖48个反应孔的液体均匀灌注的。因此，我们建议发表论文中的关键词以TaqMan low-density array或TaqMan Array Card为宜。

       每张TAC有8个独立液流通道，每个通道连通48个容积1-1.5μL的微量反应孔，共384个孔。所有反应孔两两对称排列于主液流通道两侧。每个孔内含有为目标核酸和质控基因定制的高品质且标准化生成的正向、反向引物（浓度约900nM）、Taqman探针（200-250nM）冻干后沉积物。

       吸取100μL预先与TaqMan通用预混液混匀的DNA或cDNA样品，经TAC每个检测通道加样口注入液槽中，经简单密封、离心后，装入QuantStudio 7 Pro或QuantStudio 7 Flex、ViiA 7或7900HT Fast实时荧光定量PCR仪，即可像常规qPCR反应一样完成扩增反应与分析。

       与常规384孔PCR板反应体系的构建须使用移液工作站或多通道移液器等额外设备协助的操作不同的是，TAC上样只需一支200μL的单道手动移液器、一台离心机即可完成上样方式，实验准备步骤简单，不同反应孔分注体积误差小，实验结果一致性和重复性好。

       每张TAC可以同时运行384个实时荧光定量PCR反应，实现12-384个目标核酸同步检测分析，实现了常规单重和多重实时荧光定量PCR反应难以企及的实验通量和效率。

二、TaqMan Array Card在生物医学实验研究中应用

       TAC拥有384个PCR反应通量，一次运行可检测数十个甚至以百计靶标。对临床不明原因感染性疾病病原体的快速筛查具有重要价值。美国CDC在2011年就开发出集成细菌、病毒共21种呼吸道常见病原体靶点检测TAC，用于社区获得性肺炎住院患者中肺炎支原体、病毒感染的鉴别。美国弗吉尼亚大学则开发了针对19种肠道病原体基因的TAC检测卡，依托全球肠道多中心研究 (GEMS)计划支持，在巴西、东南亚、南亚和非洲等低收入国家与地区，大规模用于小儿腹泻、肠道炎症的病原体的检测。此外，TAC还被大量应用于土壤传播蠕虫、血吸虫病、隐孢子虫、蛔虫感染的流行病调查项目等。 

       TAC的高通量、多靶点同步检测特性，赋予它在疾病遗传分析、基因表达和转录水平调控机制研究、疾病诊断/治疗/预后/治疗耐药性的生物标志物、生理病理活动的信号通路分析、microRNAs (miRNA）表达水平、细胞因子表达、药效毒理学机制分析、干细胞分化等诸多领域巨大应用潜力，而取得的成果可谓异彩纷呈。 

表1 2016-2021年知名高分期刊刊发的部分TAC实验应用文献

        DICER1是一种编码RNase III的基因，其突变导致miRNA功能失调极易诱发多发结节性甲状腺肿（MNG）、胸膜肺母细胞瘤（PPB）、卵巢性索间质肿瘤（SLCT）等多种肿瘤。用TAC和7900HT Fast 实时荧光定量分析系统，对携带突变型（共5个突变位点）和野生型DICER1基因的MNG、SLCT-MNG患者家族成员的外周血液淋巴细胞、MNG和SLCT组织中DICER1的miRNA进行了检测。结果表明：DICER1突变易导致家族男性罹患MNG，而女性成员对MNG、SLCT有易感性。 

       孕激素X受体(Pregnane X receptor, PXR)为肝内异种生物核受体，协调生物转化酶及药物转运蛋白功能，参与药物代谢和肝脏解毒过程。利福平、苯巴比妥等多种化合物均可作为激动配体与PXR结合，进而触发肝细胞CYP3A4和CYP2C9药物代谢酶基因、UGT1A1酶、ABCB1转运蛋白等多种基因的转录。人类编码PXR受体基因NR1I2的近端启动子内存在雌激素受体、糖皮质激素受体α等结合位点。采用TaqMan Array Human MicroRNA Card，对肝细胞的754个miRNA筛选分析后发现，利福平治疗后miR-18a-5p表达上调，但miR-18a-5p上调会抑制NR1I2表达和CYP3A4基因诱导。而糖皮质激素不仅通过启动子区域上调NR1I2表达，还与3′-UTR结合域上调NR1I2表达和下调miR-18a-5p的表达。由此揭示了肝细胞中糖皮质激素对NR1I2表达调控的路径机制。 

       血清素(serotonin) 即5-羟色胺(5-HT)，参与调节摄食、运动、记忆、疼痛及精神情绪等生理病理过程。脑干中缝背核（dorsal raphe）聚集了高密度血清素能神经元（serotonin neuron）。用定制TAC，对切除卵巢猴子单独用雌二醇或雌二醇+黄体酮治疗前后动物脑组织中，25个与DNA修复和神经退行性疾病（NDDs）相关基因表达的变化。这些基因包括：DNA修复相关基因（NSB1、NTHL1、LIG4、PCNA、POLG、SHFM1、GADD45A、RAD23A、APEX1、GTF2H5、PARP2、XRCC1、SHRPH）；伴侣蛋白-热休克蛋白基因（HSP90、HSP70、HSP60和HSP27）；泛素酶（ubiquinases）基因（UBEA5、UBE2D3、UBE3A）；转运马达蛋白（transport motors）基因（KIF5B、DNCLC1、DCTN4、MAPT）和4个疾病特异性基因（SCNA、ADAM10、APP和PSEN1）。结果表明：卵巢类固醇激素对血清素神经元生存能力有益。雌二醇或雌二醇+黄体酮治疗增加与DNA修复、蛋白质折叠、蛋白质降解、轴突运输和2个正常基因的表达相关的基因表达（这些基因在神经退行性疾病中处于病理状态）。表明这些基因对5-HT神经元表达和调控可能介导了NDDs潜在疾病过程。 

       缺氧诱导因子-1(HIF-1α)是细胞缺氧反应的主调节因子，特异性诱导microRNA-210(miR-210)表达上调，并在介导肺血管组织中的缺氧作用方面发挥重要作用。但miR-210和线粒体间的作用机制未知。将人肺动脉内皮细胞(human pulmonary arterial endothelial cell, HPAEC) 暴露于0.2%-12% O2条件24小时作为缺氧细胞模型，采用TAC对365种人类miRNA的表达水平进行了检测。结果显示：在HPAECs中，只有miR-210、miR-21、miR-26b、miR-146a、miR-146b、miR-150和miR-328经缺氧诱导表达上调超过1.5倍，但只有miR-210的上调超过增加25倍并呈现氧依赖式上调。小鼠PAECs缺氧暴露后miR-210表达上调了100倍。Western Blot结果显示，0.2% O2暴露HPAECs 细胞的miR-210水平显著上调的同时，ISCU1/2蛋白水平出现显著下调，并持续时间长达缺氧暴露60小时。提示了miR-210直接抑制ISCU1/2表达的内在关联，与生物信息学算法预测的铁硫簇组装蛋白ISCU1/2是miR-210缺氧细胞反应直接靶标的结论一致。说明缺氧时，miR-210通过在下调ISCU1/2的表达，降低调节线粒体功能的铁硫酶、线粒体复合体I和乌头酸酶的比活性。据此确定miR-210和ISCU1/2在缺氧应激期间调节线粒体呼吸和代谢的功能和调控机制。 

       资料显示，TAC在信号通路介导病理变化，药效毒理评价、肿瘤耐药机制、干细胞分化调控、细胞因子mRNA表达谱分析，病理标志物筛查和预后评价，基因敲除动物模型验证、病毒感染与细胞免疫机制等方面应用后，所取得的成果不同凡响。

（待续）