试论凝胶成像分析系统在菌落计数中的应用-上

悟凝胶成像仪性能为图像分析开新局-4

       菌落(colony)又称细菌集落，是由同种微生物的单个菌体或孢子在一定培养条件、一定固体培养基上生长繁殖后形成的肉眼可见的聚集体。

       现行国标规定：可手工或用菌落计数器测定菌落的数量，计数单位为CFU (colony-forming units)，以cfu/g或cfu/mL值表示被检样品的微生物菌落总数。

       凝胶成像分析系统，除主要用于常规电泳凝胶图像采集与分析外，厂家技术资料常提及Colony counting，即细菌菌落计数、克隆计数功能。但实际工作中，用凝胶成像分析仪进行克隆计数的较为少见。这是因凝胶成像分析系统在菌落计数功能上存在诸多短板难以满足计数要求，还是缘于业内长期以来菌落计数使用习惯所致？

一、国家技术标准对菌落计数的要求
       现行国家标准文件中的微生物菌落总数检验的规范流程规定，可用肉眼或放大镜辅助观察法直接标记计数，或采用菌落计数器进行计数。
       其中有两个文件的局部内容与菌落计数器的使用有关。
1.1 《医药工业洁净室（区）浮游菌的测试方法》
       《医药工业洁净室（区）浮游菌的测试方法》中的菌落计数部分规定：
       【细菌种类繁多、差别大，计数时一般用透射光于培养皿背面或正面观察，不要漏计培养皿边缘生长的菌落。】
       【平板上2个或多个菌落重叠，若可区分开则应以2个或多个菌落计数。】
       可见，菌落计数器的使用至少有三个要点：
       菌落计数用光源：透射或反射白光源均可满足要求，透射白光更佳；
       菌落计数选区设定：选区范围应覆盖培养皿底部整个培养面；
       重叠菌落的分割：对距离近而相互粘连菌落的分割计数。

1.2 菌落计数器校准规范
       尽管菌落计数器的技术性能、使用规程尚无国家标准。但已先行颁布了《JJF 1751-2019 菌落计数器校准规范》。
       规范所列的菌落计数器校准事项中包括：
1.2.1 菌落计数器功能
       菌落计数器是可对经处理培养皿上菌落自动分析计数的仪器，由光源、CCD图像传感器、图像处理系统及计数显示设备等。分析时彩色图像传感器获取培养皿图像，专业软件对图像中的菌落进行分析识别和统计,从而获得培养皿上的菌落总数。
1.2.2 校准规范适用范围
       适用于具有扫描成像系统并根据图像自动进行计数的菌落计数器及其他类型的菌落计数器的校准。
1.2.3 菌落计数仪器校准项目
       鉴别力：用仪器可识别的最小菌落的直径表示菌落计数器的最小菌落的识别能力。
       分辨率：数码成像系统或成像组件分辨图像细节能力。

二、凝胶成像分析系统的硬件实力
       正如《如何有效评价凝胶成像分析系统的技术性能-透射白光的配置应用》文中所述，凝胶成像分析系统通常标配有反射型白色光源，还可视实验需要加配透射型白光光源。

       凝胶成像系统再充分发挥自身高分辨率图像采集功能，故硬件上足以满足常规菌落计数应用的技术要求。
1）应用的合理性
       凝胶成像分析系统的硬件组成、图像采集和分析工作模式，已具备《菌落计数器校准规范》界定菌落自动计数类仪器的全部特征和功能。因此，是可以名正言顺地纳入菌落计数类仪器范畴的。
2）技术的可行性
       多数菌体的单体需借助光学显微镜放大数十倍后才能现形。但成千上万的细菌聚集生长形成的菌落，则足以凭肉眼即可轻松分辨和观察。资料显示，按食品安全国家标准食品微生物学检验规范指定培养条件，金黄色葡萄球菌所形成的圆形菌落直径2-3mm。而经验表明，大肠杆菌经LB培养基37℃培养18小时所形成菌落的直径可达1.5-2.0mm。
       就凝胶成像分析系统的图像分辨能力看，早在2000年前后上市的伯乐Gel Doc 2000系统（CCD分辨率768H×494V像素，最大成像面积25×26cm），对应于被分析样品上，其几何尺寸区分能力就已达0.5mm，足以分辨直径1.0mm大小的实验培养菌落。而新型凝胶成像分析系统，如伯乐GelDoc Go凝胶成像分析仪（630万像素，最大图像区域14L×21W cm），国产勤翔GenoSens 2000系列凝胶成像分析仪（605万像素/2048×2560 pxls、最大图像区域19L×26W cm），对实物上两点间距的分辨能力已升至0.1mm以内，这对于可靠捕获绝大多数实验培养菌菌落图像的任务，已是绰绰有余。
       因此，在凝胶成像分析系统上进行常规菌落计数工作，可谓合情合理，水到渠成。

三、凝胶成像分析系统的菌落计数功能原理
       凝胶成像系统图像分析软件的菌落计数功能，是基于灵活高效图像采集控制与强大的图像分析能力实现的。
       图像分析系统对菌落的识别与常规电泳凝胶图像中泳道和条带的自动识别，原理异曲同工。都是在划定的选区内基于分析对象与图像背景的灰度值差异来对目标所处位置、面积大小和色彩进行自动识别与统计。
       在菌落计数中，软件对培养皿上的菌落与周围培养基区域的局部像素强度值峰和信号分布范围，结合人工设定的强度阈值（density thresholds），完成对菌落判别、颜色的区分、直径大小以及菌落数量的自动统计。

 （待续）