试论凝胶成像分析系统在菌落计数中的应用-下

悟凝胶成像仪性能为图像分析开新局-4

四、凝胶成像分析软件的菌落计数分析功能类型
       归纳起来，专业凝胶图像分析软件可提供多种菌落定量分析功能，满足不同类型微生物菌落检测需求。
4.1 自动计数、预设模板计数和手动计数
       自动计数功能（Automatic Counting）：调整好图像大小，使用矩形、椭圆、多边形工具定义分析区域范围，选择"自动计数"菜单，系统将自动完成选区内全部菌落计数，并在图像上显示。
       与之类似，在预设模板分析模式（Template Counting）下，调用预设条件模板，软件将按模板设置要求自动完成菌落分析统计。
       手动计数（Click and Add Counting），人工肉眼识别图像上的菌落，手工逐一“点选”，被选中的菌落自动突出显示并以数字标示，在完成菌落计数后，软件给出计数图像分布与统计结果。

4.2 颜色分类计数
       菌落外形特征是辨认菌种的重要依据。细菌、酵母、霉菌等不同类型微生物，在不同培养基上形成外观特征，如菌落大小、形状、边缘、颜色、光泽和透明程度等，存在差异。而同种细菌、在相同培养条件下形成的菌落特征具有稳定性。
       在Identify by Color Counting计数模式下，软件可按颜色区分不同菌落，并根据颜色属性分类统计。一次分析可完成培养皿中不同类型菌落检测计数。
       在定义计数选区，选中第一重颜色菌落后，系统自动识别和计算所有与采样点相同颜色的菌落。通过分类添加操作，可进一步定义和自动分析其他菌落类型，直至完成选区的全部菌落。

4.3 区带分析
       区带分析（Zone analysis）功能可提供图像选内各个独立菌落分布范围的面积、直径大小统计信息，常用于抗菌和抑菌效果评价实验中被检样品的抑制圈直径大小的测量等检测。

4.4 选区排除计数
       国标对于菌落计数选区的选择有明确技术要求。
       《食品安全国家标准食品微生物学检验-菌落总数测定》规定：以无片状菌落生长的平板进行菌落计数；若成片状生长的菌落比例不到平板培养面积的一半,而另一半区域菌落分布均匀,则可计算半个平板后乘以2,代表该平板菌落总数。
       如培养皿的特定区域图像有污损，不符合计数要求，或实验者不想将这部分菌落列入最终计数结果中，则可通过某些在凝胶成像分析软件的"忽略区域"命令（Ignore Region），将该图像区域排除在计数选区外。
       经验人士指出，实验中应尽量避免在培养皿的底面写字标记。除非在计数前图像经适当处理消除字迹，否则字迹部分会被错误地识别为菌落，干扰计数结果。

4.5 螺旋平板计数
       螺旋接种法，是政府微生物专业检测机构、食品药品和化妆品生产企业进行样品菌落总数检测、培养基质控中常用接种手段，已被FDA、AOAC、APHA、ISO 7218、我国GB 4789.28-2013及SN/T 2098-2008等收录。
       螺旋板计数功能，Spiral Counting，正是针对螺线平板接种法开发的自动计数模块。
       执行螺旋板分析命令，系统生存一张阿基米德螺旋形网格叠加在计数图像上。移动和调整网格到大小和位置实现螺旋网格中心与螺旋平板图像中心准确对齐，软件将显示螺旋板分析窗口并可自动显示计数结果。

4.6 计数条件设定和修正
       《医药工业洁净室（区）浮游菌的测试方法》规定：
       1）须区分细菌菌落或培养基沉淀物，剔除被错误识别为菌落的图像背景计数；
       2）平板上有2个或多个菌落存在重叠，在可有效分辨的情况下应按2个或多个菌落计计算。
       为确保菌落计数器或人工计数结果的准确性、减少误差，需设定合理分析条件，且在必要时执行增加/删除、分割（Split Colonies）/合并菌落（Merging Colonies）操作。
       凝胶成像分析软件的菌落计数模块，设置有多个计数条件设置选项和修正计数功能，足以胜任菌落计数过程的质控管理任务。
4.6.1 菌落分割/合并功能
       当两个或多个菌落距离太近而被软件识别为一个菌落时，可通过Manual Split Colonies命令手工操作或借助于Auto Split Colonies命令自动实现黏连菌落的分割。
       当一个菌落被错误地识别为两个独立菌落时，可以通过Merging Colonies命令手动合并两个菌落。

4.6.2 菌落图像强度阈值设置
       软件的自动计数是基于分析对象与图像背景的灰度值的差异，如培养皿上菌落比周围区域更暗或更亮。而图像强度阈值（Density Thresholds）设置规定了分析对象图像灰度值的范围。软件将图像中像素强度处于高、低两个阈值之间的分析对象视为细菌菌落统计，提高计数准确性。

4.6.3 设置菌落大小尺寸
       图像分析对象大小不同，如仅需对特定大小的菌落计数，可使用区域控制（Area Controls）命令，设定被统计菌落的直径大小范围，则直径值处于设定区间的对象视为计数对象。

4.6.4 用直方图区分菌落
       凝胶成像分析软件菌落计数模块，可用直方图显示检测到的全部菌落图像信号强度分布范围。如果图像中有白色、蓝色两种菌落，则直方图上会显示两个清晰信号峰。
       直方图计数窗口设有控制滑块，可设置菌落-图像背景、白色与蓝色信号强度值界限。拖动滑块时，菌落数量、白色、蓝色菌落的数量将自动调整。

五、讨论
       凝胶成像分析软件依托自身强大图像量化分析算法，为菌落计数提供了全面的菌落分类和量化信息，包括菌落的种类数、每类菌落数量和类百分比；菌落整体和每类菌落的面积、菌落周长、菌落平均直径和菌落圆度(numerically depicts roundness of the colony)统计数据等。就功能和适用性而言，与全自动菌落计数仪难分伯仲。因此，充分发挥实验室既有凝胶成像分析平台资源，开展常规微生物菌落计数工作，科学合理，简便易行。
       无须讳言，不同品牌凝胶成像分析系统软件集成的菌落计数功能模块种类、数量存在区别，分析条件设置要求也不尽相同。
       此外，凝胶成像分析系统自身硬件条件所限，无法使用新型自动菌落计数仪装备的暗视野底部透射光源（下光源），菌落表面立体细节呈现效果不佳。部分机型LED反射白光色温偏冷，一定程度上影响对菌落真实色泽的还原。

参考文献
［1］ GB4789.2-2016食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定
［2］ GB/T 16293-2010 医药工业洁净室(区)浮游菌的测试方法
［3］ WS/T 650-2019 抗菌和抑菌效果评价方法
［4］ JJF 1751-2019 菌落计数器校准规范
［5］ Life Science Software Installation and User Instructions, Rev L
［6］ Quantity One User Guide for Version 4.4, Rev A
［7］ AlphaView Software User Guide, Revision 3A