如何有效评价凝胶成像分析系统的技术性能-透射白光的配置应用

悟凝胶成像仪性能为图像分析开新局-3

一、白光光源在凝胶成像分析仪中的配置
       资料显示，国内外凝胶成像分析系统厂家，在考马斯亮蓝染色、银染等可见光凝胶成像分析应用中检测光源的配置问题上，意见是不一致的。
       譬如Alpha公司的经济型凝胶成像系统AlphaImager EP，标准配置为反射白光双侧白光灯（Epi white lights），透射白光板作为选配件。而经典型AlphaImager HP凝胶成像分析仪、AlphaImager FluorChem HD2 WB成像分析系统、FluorChem MWestern Blot印迹膜多色荧光成像系统，则同时将双侧反射白光光源和透射白光板（white light table）作为系统标配。
        UVP公司BioDoc-It 2 Imaging Systems普及型凝胶成像仪标配双侧反射白光光源，透射白光板（White Light Plate）为选配件。高端BioSpectrum Imaging System凝胶成像分析系统，则兼有反射型白光照明（Epi Illumination）、LED白光透射仪（LED White Light Illuminator）两种白光光源。
       伯乐经典Gel Doc XR+ 凝胶成像分析系统，标准白光光源包含透射白光板（White Light Transilluminator）和反射白光照明（epi-white illumination）。而GelDoc Go凝胶成像仪提供反射白光（Epi-white）做基础白光光源，把紫外转换型透射白光样品盘（optional white tray）作视为非必需件。
       标准配置只提供双侧LED 白光反射灯的现象，在进口Axygen GD-1000/GDBL-1000凝胶成像分析仪、国产勤翔GenoSens 2000系列凝胶成像分析仪、天能Tanon 1600凝胶成像仪上都可被观察到。

       通常认为，双侧LED 白光反射灯在凝胶成像中主要用于考染、银染等蛋白质电泳胶的观察和拍摄；此外，在上样时作为照明调整样品位置以及镜头的精确对焦。
      而亮考染色、银染蛋白质电泳凝胶观测的功能，与透射型白光光源作用是一致的。
      既然反射白光就能满足蛋白凝胶可见光成像需要，为何不计成本、多此一举，还要开发透射型白光板？到底反射白光与透射白光作为检测光源应用上有何本质区别？
      在回答前，先看看图像分析领域的权威软件关于反射和透射光源在图像量化分析中应用要求。

二、ImageJ软件用户指南关于反射和透射光源在图像量化分析中应用要求
      在ImageJ软件用户指南的《XXIV Using Scanners in Densitometry》附录说明中有如下内容。
    【Electrophoretic gels such as Western blots need frequently to be quantified in order to translate biochemical results into statistical values. Independently of the measurement method, you should be familiar with the Beer–Lambert law, so that you are aware that the optical density (absorbance) of the staining to be measured must be proportional to the concentration of the probed material.】

    【Samples must be scanned in transmission mode.】

    【Scanners can only serve as densitometers if the light source and detector are on opposite sides of the instrument (transmission mode). This is critical for quantitation of absorbances and requires an adapter for transparencies or negatives to be mounted or built-in on the scanner.】

    【Most flatbed scanners have the light source and detector located on the same side of the instrument (reflection mode). Under these conditions, light interacts with semi-transparent objects in a complex manner with reflected light re-passing through the object on its way to the detector.In addition, thick samples (such as Coomassie-stained gels) are imaged from the surface under reflection light.】

      概括起来，可以这样解读：
      1）常规染色后核酸蛋白质电泳凝胶图像量化统计分析，前提须是条带染色后的光密度（吸光度）大小与被检测样品的浓度成正比。这样才符合Beer–Lambert定律；
      2）样品必须以透射光模式进行扫描
      只有当检测光源和光信号探测器位于被检测样品的两侧，光线直射穿透样品后进入扫描仪探测器获得的图像，才能作为样品光密度的量化依据。这对于吸光度检测至关重要。
      3）反射式检测光源不符合Beer–Lambert定律应用要求
      大多数平板扫描仪，由于光源和探测器位于被检测样品的同侧，属于反射模式扫描。
      在反射条件下，光以复杂方式与半透明的物体相互作用，经历多次反射、透射后进入探测器，检测器接收的反射光信号成份十分复杂。考马斯亮蓝染色蛋白凝胶等物品存在一定厚度且对光通透，而凝胶表面会反射检测光线。垂直射向凝胶检测光线会有多次反射、透射，探测器采集的染色图像不能真实代表凝胶样品实际对透射光的吸收程度。因而，反射模式下样品成像不可作为凝胶图像和X-射线胶片量化分析的依据。
      我们把ImageJ图像分析软件指南中的规则应用于凝胶成像分析系统中，得出如下推论。
      A）双侧反射白光，只能为亮考染色凝胶观察与拍摄提供基础照明作用，但反射光呈现的图像染色深浅与凝胶中样品实际含量并无直接关联。基于反射光成像获取的凝胶图像，不可作为样品中蛋白定量的依据。
      B）按照Beer–Lambert定律，检测光线须是直射穿透检测样品，入射光线力求平行而均匀。如需基于样品图像进行样品含量量化分析，只能采用透射模式下采集的图像。
      因此，对于根据染色来评估蛋白表达峰度的实验应用，透射白光光源的配置是必要和科学的。譬如，在蛋白组学双向电泳实验中，2D凝胶的透射扫描就是不可或缺的环节。
      当然，凝胶光密度分析结果特异性，相对于Western Blot实验借助于蛋白印迹免疫检测技术，的确不可同日而语。
      C）凝胶成像分析系统配置的透射型白光光源，除了可用于蛋白凝胶的成像定量分析，还可用作X线检测底片的扫描成像，如临床医学X线、CT和MRI体检底片，Western Blot实验采用放射线自显影检测技术获得底片等影像资料。

三、小结
      总结起来：凝胶成像分析系统标配反射白光光源是实用的；如需对凝胶染色后定量分析，或需对包括采用放射自显影路线获取WB实验检测底片等X射线影像资料进行量化分析，配置透射型白光光源具有重要使用价值。

参考文献
［1］FluorChem HD2 and FC2 User Guide，Revision 2（P/N 94-15068-00）
［2］BioSpectrum Imaging System Instruction Guide 81-0207-01 (Rev. O)
［3］ImageJ User Guide_IJ 1.46R