操作规程
关于抑郁症人脑皮质类器官建模的讨论
重度抑郁症(Major depressive disorder, MDD)是导致残疾、自杀的主要原因。百忧解等SSRIs制剂起效慢、副作用多、不能缓解自杀倾向，且有约1/3病例治疗无效。氯胺酮(Ketamine)可在两个小时内缓解抑郁症状，包括对SSRIs无效的难治性抑郁症患者，并可舒缓成年抑郁患者的自杀倾向，但有致幻作用和大剂量治疗后的成瘾性。艾司氯胺酮（Spravato)是从组成氯胺酮的两个同分异构体中分离出来的右旋分子，疗效与氯胺酮相当，但须由医生监护服用，有致幻、分离样精神类症状等副作用及成瘾风险。迄今为止，深入理解MDD病理机制，开发快速起效又无致精神类症状副作用的抗抑郁药，具有重大意义。
一、抑郁症GABA能中间神经元调控失常理论
大脑皮层是由各类神经元组成的复杂的超级神经网络，是脑高级认知功能的结构基础。皮层神经网络中兴奋性与抑制性的动态平衡是脑功能正常发挥的重要前提。抑制性γ-氨基丁酸（GABA)能中间神经元GINs可通过摄取谷氨酸合成并释放GABA调节兴奋性神经元的活动，是皮层抑制回路的主要组成部分。大脑皮层中的生长抑素神经元(somatostatin，SST)和小清蛋白神经元(parvalbumin，Pvalb)相关GINs的异常，可以引起兴奋性与抑制性失衡。
而来自死后脑切片的免疫组织化学证据、MDD 的动物模型观察到细胞和生化变化表明，包括大脑中GABA浓度降低，GABA-A型受体及催化谷氨酸转化为GABA的关键酶——谷氨酸脱羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD)（GAD67)蛋白表达减少。而临床实践则显示，MDD患者经药物、电休克治、经颅磁刺激治疗或认知行为疗法后，大脑内GABA 含量升高，抑郁症状减轻 [1-2] 。分析前额叶皮质GABA 能网络的结构和功能完整性破坏，很可能是MDD的病理生理学基础。
东莨菪碱通过对内侧前额叶皮层(medial prefrontal cortex，mPFC)中的GINs的瞬时抑制促进突触可塑性 [3] 。氯胺酮通过抑制N-甲基-D-天冬氨酸受体GluN2A亚基，增加海马区兴奋性神经元的自主可兴奋性 [4] 。两种快速抗抑郁药的效用机理研究证据都指向GINs在MDD治疗中的关键作用。
二、GABA能中间神经元相关抑郁症脑皮质类器官构建原理
大脑皮质中的GINs占皮层神经元数量20%，分布广泛，其形态、基因表达、环路连接以及神经电生理活动模式等具有多样性。正是GINs的异质性使得人类大脑具有复杂精细的神经调控网络和高级认知情感功能。探究GINs的起源及其多样性的发育机制，是神经科学领域目前亟待解决的核心科学问题之一。
GINs起源于位于妊娠中期胚胎发育的腹侧端脑(ventral forebrain or subpallium) 【注：胚胎端脑起源于胚胎前脑泡，随后进一步发育成熟才形成由左右半球、半球联合部级内间腔，有完成解剖结构的端脑)的神经节隆起（ganglionic eminence, GE。属于胚胎发育早起大脑的过渡性结构，随着大脑发育成熟而自然消失】。在GE中确定特定功能后，GINs会在人类胎儿发育的几个月内先作远距离切向迁移到皮质层，继而通过径向迁移(radial migration)方式散布于整个大脑皮层，经历活动依赖的成熟过程，最终整合到皮层神经回路中。这一过程中的遗传或环境因素扰动，可能导致皮层兴奋性和抑制性失衡，被认为与包括癫痫、自闭症谱系障碍（ASD)等神经精神障碍有关 [5] 。GE根据解剖位置的不同分为内侧神经节隆起(MGE)、外侧神经节隆起(Lateral ganglionic eminences, LGE)和尾神经节隆起(CGE)。GE中的神经祖细胞也包括放射状胶质细胞（RGCs)及中间神经元祖细胞（IPCs)。祖细胞经分裂后的演变成为神经元根据基因表达差异可以进一步区分为MGE，LGE及CGE细胞群。人脑中的MGE细胞主要分化为皮层及海马中的GINs及皮层下脑区的GABA能GINs及胆碱能神经元以及部分特异性表达CRABP1及NKX2-1的神经元。MGE中间神经元的多样性在它们在仍处于祖细胞时就已经定义。而GINs多样性的提前定义对于指导GINs准确沿着迁移路径完成迁移，进而精准地参与神经环路建立极为重要。这个过程对于大脑皮层发育十分关键。与啮齿类比较，人脑中的GINs不仅数量更庞大，而且类型更丰富。MGE起源的CRABP1 + NKX2-1+ 以及CGE起源的SCGN + CALB2+ 两种在人脑中特异性存在的中间神经元前体细胞，不仅在发育过程中存在也存在于成年人的大脑皮层中 [6] 。
由于人脑皮质回路中的GINs关键发育过程主要发生在人类胚胎早、中期，人类胚胎实验材料的获取大多数情况下都难以企及 [7] 。显然，构建类似于大脑前额叶 GABA 能神经网络的结构和功能的类器官模型，只能遵顼胚胎时期人脑皮质本来的发生、发育路径，采用人类多能干细胞来源含GINs腹侧前脑类器官与含有谷氨酸能神经元的前脑皮质共培养，在GINs分化完成后按自然规律完成向皮质的定向迁移，在皮层整合和进一步发育。可喜的是，相关脑区特异性神经球体及组装、整合探索工作已由斯坦福大学医学中心的研究团队于2017年宣布成功完成（过河有可摸的硬石头了)。
三、 MIAOU标准视角下抑郁症人脑类器官表征内容
基于学界对脑类器官的定义，抑郁症脑类器官应是由hPSC 衍生的祖细胞、神经元和神经胶质细胞在体外自组装而成，并在一定程度上具备抑郁症患者体内发现的神经组织发育特征的三维结构细胞模型。
好类器官的定义标准是更忠实地概括人脑特征。鉴于GINs特殊的起源、迁移和发育规律，大脑皮质类器官理应是腹侧端脑和大脑皮质两个区域特异性脑类器官有机组装衍生的类器官组装体。艾伦脑科学研究所建立的综合人脑图谱，包含免疫组织学、原位杂交和转录组学数据（transcriptomics），为类器官实验研究者提供宝贵的参考资料 [8] 。
欧盟《关于类器官及用途的最低限度信息标准》（MIAOU标准信息规范)中，将类器官表征列为类器官实验标准化体系的元数据(metadata)内容加以规范，以提高不同组织类器官来源、样品批次研究间的可重复性(reproducibility)、可复制性(replicability)，促进类器官生产稳健性的同时，方便研究人员自信地与其他科学家分享研究经验。MIAOU所列的类器官表征工作的内容，包括结构组学（基因组学、转录组学、蛋白质翻译后修饰、细胞代谢、器官特有的生物标志物等)、形态学以及视类器官用途而定的具体功能测读等 [9] 。
大量研究已证实，与健康人iPSCs来源的神经元比，MDD患者iPSCs来源的各种类型的神经元、神经胶质细胞,都出现神经元突触连接及树突棘数量异常等形态、线粒体功能受损、电生理特性以及包括 CACNA1C(钙信号传导)、SLC6A4(血清素转运)和BDNF(突触可塑性)等差异表达基因(DEGs)和神经元的HTR2A、HTR7受体表达变化 [10] 。因此，对以GINs发育调控功能研究为核心的腹侧脑类器官模型,和对用于抑郁症研究的腹侧脑类器官模型的表征，两种这研究目下，标准方法和要素应该是有所区别的。后后一种应用条件下，所构建的模型理应在抑郁症表型上有所体现。
表1 所引范文与MIAOU标准对类器官表征元数据的对比
MIAOU标准内容 | 范文披露内容 |
形态学/结构 | |
描述外观、大小、形状等。 | 单个GIN形态Sholl分析 |
评估不透明度/折射率。 | / |
量化器官内和器官间的同质性 | GABA和TUJ1阳性细胞计数 |
形态学、结构和超微结构特征以及组织细胞类型 | 单个GIN形态Sholl分析 |
分子表征 | |
提供基因组、转录组、代谢组和蛋白质组学信息 | 5-HT2CR蛋白质表达水平Western分析； 5-HT2CR mRNA实时PCR分析； 转录组分析(Bulk RNA-seq) 单细胞RNA测序（scRNA-seq) |
指出预期的特异性分子标记物、表观遗传特征 | 免疫细胞化学（Immunocytochemistry) 细胞标志物荧光图像定量分析： 神经祖细胞标志物 SOX2； 腹侧前脑祖细胞标志物 NKX2.1； GABA 能神经元标志物标志物GAD67； |
功能表征 | |
定性和定量的功能特征 | 单细胞钙活性共聚焦成像定量分析（Calcium imaging) GIN神经元活性全细胞膜片钳记录分析 |
说明处理方案（药物、化学、物理、激素等) | 钙成像：Fluo-4 AM 加载溶液 电生理测定：Trzd 处理 |
可追溯性和类器官漂移 | |
描述组分的可追溯性（批次、供应商等、环境、补充物) | iPSC维持：Essential 8培养基培养 iPSC分化：神经诱导培养基（NIM: 500ml F12 + 5ml N2 + 5ml NEAA) iPSC细胞解离试剂：Stemcell，1 ml/孔 类器官培养：Matrigel |
给出条件培养基可追溯标准 | / |
类器官的定性漂移标准（形态学、结构、功能、分子等) | / |
评估稳健性（相同的起始细胞，相同的类器官)？ | 人外周血单核细胞(PBMC) CytoTune-iPS 2.0试剂盒PBMCs重编程 腹侧前脑类器官 |
整体上，sMDD-GINs一文实验部分对GIN神经元生成的腹侧前脑类器官表征要素，基本符合欧盟MIAOU标准表征技术要求。
不足之处在于对该类器官细胞抑郁症有关表型的表征工作内容不够充实。GAT1与GABBR2、GAD65与GAD67通常被视为GABA能神经元标志物。GAD67作为是人脑中早期大脑GINs发育的特异性GAD亚型。而GABA转运蛋白1（GAT1)和GABA受体2（GABBR2)则是在GIN细胞膜上的表达两种GABA转运受体。GABA转运体主要负责突触释放的GABA的重摄取，控制细胞外GABA的浓度，而调节下游神经元的电兴奋性。实验中关注了神经元发育中的GAD67的表达，但对于GAT1与GABBR2，无论是基因转录层面、蛋白表达层面菌未提及。此外，大量报告观察到的MDD患者iPSC来源神经元生物能量和线粒体代谢异常问题，文中亦未涉及。
四、 GABA能中间神经元相关抑郁症脑皮质类器官方法问题
2017年，斯坦福大学医学院精神病学与行为科学系Fikri Birey等人的“Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids”在Nature发表。文中介绍在已经建立的大脑皮层（pallium, hCS)区域特异性3D 神经培养物（包含深层和浅层皮质谷氨酸能神经元以及星形胶质细胞)基础上，构建了皮层下(subpallium, hSS)脑区神经球体，经hSS-hCS共培养生成了同时包含皮质谷氨酸能神经元、星形胶质细胞及GINs的前脑球体的组装球体（assembly of forebrain spheroids)，即组装前脑类器官 [7] 。
sMDD-GINs一文强调其类器官实验方案是基于2020年发表研究报告中的方法改进而来，同时提及Birey等人的上述文章。
表2 两篇报告中类器官生成过程元数据信息的对比
文献来源 | Nature. 2017 | Protein Cell. 2020 |
hCS的生成 | 用0.35mg/ml的分散酶将完整的hiPSC细胞团从培养板上挑出，并转移到含有两种SMAD抑制剂——dorsomorphin（DM；5μM；Sigma)和SB-431542（SB；10μM，Tocris)，及ROCK抑制剂Y-27632（10μM；EMD Chemicals)的hPSC培养基中的超低吸附塑料培养皿中。 在最初5天里，每日更换一次hPSC培养基，并添加DM和SB-431542。 第六天，悬浮培养的神经球被转移到含有Neurobasal-A（Life Technologies，10888)、无维生素A的B-27补充剂（Life Technologies，12587)、GlutaMax（Life Technologies，1：100)、青霉素和链霉素（Life Technologies，1：100)的神经培养基（NM)中，并添加生长因子EGF（20ng/ml；R&DSystems)和FGF2（20ng/ml；R&D Systems)，直至第24天。 从第25-42天，培养基中补充生长因子BDNF（20ng/ml；Peprotech)和NT3（20ng/ml；Peprotech)，每两天更换一次培养基。 从第43天开始，类器官在无补充物培养基中维持，每4-6天更换一次培养基。 | 背侧脑类器官的生成： 胚胎体(EBs)在神经诱导培养基(NIM)中连续培养至第35天或更长时间（在自发条件下培养，不经慢病毒转染)。 |
hSS的生成 | 在培养的前23天，培养基中添加了额外的小分子 从第4天到第24天添加Wnt信号通路抑制剂IWP-2（5μM；Selleckchem)。 从第12天到第24天添加SHH信号通路激动剂SAG（100nM；Selleckchem)。 从第25-42天，培养基中补充生长因子BDNF（20ng/ml；Peprotech)和NT3（20ng/ml；Peprotech)，每2天更换一次培养基。 从第43天开始，在无补充物培养基中维持，每4-6天更换一次培养基。 | 腹侧MGE类器官的生成： 胚胎体(EBs)在神经诱导培养基(NIM)中连续培养,从第10天开始到第25天，每日加入500nM SAG。 |
病毒标记 | 将hCS或hSS转移至含有300μL NM病毒的1.5ml微量离心Eppendorf管中，并孵育过夜。 第二天，将神经球体转移到超低附着板中的新鲜NM培养基中。 慢病毒用Lipofectamine 2000（Thermo Fisher)转染HEK293T细胞在72小时后用Lenti-X浓缩器浓缩上清液生成。 腺病毒（AAV-DJ1-hSYN： mCherry)在斯坦福大学斯生成。 | 第25天用搭载GFP的慢病毒载体转染腹侧MGE类器官。 将类器官转移到培养基培养皿中，向每个类器官中加入50μL NIM培养基以防止干燥。 类器官置于Nikon SMZ800N显微镜下，调整物镜到适当放大倍率，用微量注射器注射，每种类器官各注射两次，每次0.5μL病毒液。注射完成后加入50μL病毒稀释溶液。 孵育24小时后，类器官移至补充有3mL NIM培养基的T12.5细胞培养瓶中。 |
组装前脑球状体 | 将 8-10天前病毒标记的hCS和hSS（~60- 90天的体外分化)转入1.5ml离心管中3天，并置于CO2培养箱中培养。 在此期间，超过95%的hCS和hSS 融合。 用P-1000移液器将hSS-hCS培养物小心地转移到Corning 24孔超低吸附板中，每2-3天非常温和地更换培养基。 | 分别将一个背侧脑类器官和一个腹侧MGE类器官放在一个1.5ml的EP管中，在37℃、5%二氧化碳的培养箱中培养，三天后生成融合型类器官。 |
对比两篇报告中类器官组装体的制备方法，从PSCs分化、生成区域性脑类器官脑区到最后生成类器官前脑类器官组装体，主要步骤、关键控制时间节点基本一致，主要区别在于细胞诱导分化过程中培养基添加物的不同和实验总时间差异。据此，认定两个报告分别采用了两种不同的方法生成了具有功能、胚胎学部位一致的前脑皮质类器官组装体似无争议。
但从两篇报告中实验流程细节信息看，Birey等提供的方案显然更有参考价值。
sMDD-GINs一文，明确指出全套HPSC衍生类器官组装体的培养操作源自用该实验室2020年开发成功的实验方法生成的。但这套自创实验流程方法与而Birey等人报告的实验协议和MIAOU技术标准对比可知，实验细节描述不仅仅是过于简略问题，而是有诸多流程的元数据信息缺失，显然与欧盟MIAOU对类器官实验信息披露要求不符。
譬如:脑区类器官生成所用的HiPSCs克隆的筛选方法、传代数控制、人体材料的遗传背景控制、培养过程支原体检测结果、E8培养基补充物的信息、传代接种密度；从拟配体生成类器官过程中，培养基及所用补充物、是否使用了基质、接种条件和培养基更换频率、基质单位体积的接种密度、培养基中每单位面积的基质液滴体积、培养基用量、类器官扩增时的解离方法。两种类器官优于分化、扩增时序和时程不同，中间是否进行过超低温保存和复苏，冻存和复苏条件。
此外，在类器官转录组测序和单细胞测序环节，对类器官培养物的解离方法、单细胞悬液制备方法等，都缺少比较的描述信息。
类器官病毒感染操作的技术细节和质量控制，信息也不够详实。
类器官实验操作规范化、标准化，是目前学界共同关注和亟待解决的技术问题，理应值得所有实验则重视。所谓言之无文，行而不远。当研究工作中使用自主开发的技术方法时，更应慎之又慎。这既确保不同实验室之间的类器官培养结果具有可比性，又可以研究人员进行准确而自信的技术交流，对推动自主技术从实验室研究走向产业化发展有重要意义。而该文所提供的信息如此简略含糊，匪夷所思。较合理猜测是：这一套独创的类器官实验流程还没有真正固定成型，所生成的类器官模型稳健性还有待完善。
五、关于抑郁症人脑类器官建模何设计思路
关于抑郁症病理机制，已有神经环路功能受损说（杏仁核-内侧前额叶皮质内隐情绪调节环路、腹侧纹状体/伏隔核-内侧前额叶皮质奖赏神经环路)、神经递质（多巴胺、5-HT、谷氨酸、GABA、乙酰胆碱、组胺等)说、下丘脑–垂体–肾上腺轴调节应激反应功能受损说，肠-脑轴体系的微生物菌群代谢说，药理学家的药物靶点学说、生物学家的各种组学说等等，长期以来众说纷纭。
抑郁症人脑类器官的核心价值在于基于MDD患者遗传背景下最大程度地模拟特定脑区、脑神经环路的组织结构、细胞组成、早起发育和特征。选准模拟靶标，事关研究成效，还可避免重蹈前人失败的覆辙。
实践是检验真理的唯一标准。从快速抗抑郁药氯胺酮（已被证实为可稳定结合在GluN2B NMDA受体通道空腔内并阻断通道发挥作用)、东莨菪碱（毒蕈碱型乙酰胆碱受体M1-M5受体亚型非选择性拮抗剂)疗效看，从作用靶点出发，追溯药物受体定位的脑细胞类型、所定位的神经核团及所处的神经环路，无疑是一个确定类器官模拟靶标的合理而稳妥的设计思路。譬如，基于氯胺酮与外侧僵核抗抑郁机制研究基础 [11-12] ，以外侧僵核(lateral habenula，LHb)为核心，先构建LHB特异性脑区脑类器官，在此基础上再构建包含LHB的神经环路的类器官组装体，有利于加快抗抑郁药物筛选类器官建模工作。
而将人脑类器官与光遗传学、膜片钳、单电极和多电极阵列、基因组编辑、单细胞转录组学和表观遗传学结合，将为抑郁症遗传发育、潜在的基因调控网络等病理生理机制研究的toolbox添一利器。
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