GABA能中间神经元相关抑郁症脑皮质类器官生成和表征方法解析

       对2013年以来的抑郁症(Major depressive disorder, MDD)脑类器官研究应用有关文献的调研显示，迄今为止，绝大部分依托MDD患者iPSC衍生的各种脑细胞体外模型开展的抑郁症实验，仍属于2D单层培养技术范畴。抑郁症人脑类器官属于脑类器官领域一个年轻分支，特别有影响的公开实验报道，还不多见。

       “Depressive patient-derived GABA interneurons reveal abnormal neural activity associated with HTR2C” 一文（以下简称“sMDD-GINs一文”)刊发于2023年11月的EMBO Mol Med。该报告是根据自杀重度抑郁症(sMDD)患者尸检报告发现的GABAB 受体介导的抑制失调、GABAA受体2表达下调，有自杀行为患者大脑前扣带皮层中 GABA降低的现象，再结合依托MDD动物模型中的GABAA/B 受体缺陷、GABA合成酶GAD67表达减少而建立的前额叶GABA能网络异常导致MDD的病理学假说后，选择脑皮质中抑制性GABA能中间神经元为研究对象，在参考皮质谷氨酸能类器官-皮质下类器官组装体构建经验基础上，而首次提出了腹侧前脑类器官（ventral forebrain organoids)的概念 ^[1] 。

一、GABA能中间神经元相关抑郁症脑皮质类器官衍生方法范例

1.1 诱导多能干细胞的产生

       iPSCs 的所有实验程序，包括来自供体的血液采样，均获南京医科大学医学伦理委员会的批准（批准号2016330)。

1.1分离人外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs) ^[2] 。

       1) 通过静脉穿刺从供体收集10ml肝素化全血。

       2) 将全血用10mL D-PBS缓冲液稀释后，获得20ml稀释血溶液【注：PBS,即Phosphate-Buffered Saline，磷酸盐缓冲液，能够提供相对稳定的离子环境和 pH 缓冲能力是生物学中经常使用的缓冲盐溶液。D-PBS缓冲液，Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline，即杜氏磷酸盐缓冲液，与人体 pH 相近，溶液渗透压与人体血液等渗，不含 Ca2+、Mg2+，是具有短期维持细胞活性功能的一种平衡盐溶液。适用于解离前清洗细胞、运输细胞或组织、稀释细胞进行计数和制备试剂等各种细胞培养应用】。

       3) 将15mL Ficoll溶液（Ficoll-Paque PREMIUM)放入新的50ml锥形管中【注：Ficoll-Paque PREMIUM，即用型无菌密度梯度离心介质，设计用于通过外周血、骨髓和脐带血制备单核细胞】。

       4) 用电动移液器，将20mL稀释血液溶液沿着管内壁缓慢流动的方法，铺设至Ficoll溶液上面。注意不要混合血液溶液和Ficoll溶液。

       5) 常温下400×g离心30分钟 (Thermo CL2离心机已由Sorvall ST 8R小型离心机取代)。将离心减速速度设置为“慢”。注意：离心后，在上部乳白色血浆层和下部透明Ficoll层之间出现一层白色薄层，其中包含单核细胞。

       6) 用1ml移液器将单核细胞层转移到新的50ml锥形管中。注意不要吸入底部Ficoll溶液。

       7) D-PBS 缓冲液添加到上一步分离的单核细胞液样中至总体积为10ml，常温下200×g离心5分钟。

       8) 弃上清，向单核细胞沉淀中加入10mL D-PBS 缓冲液，再次常温下200×g离心5分钟。

       9) 弃上清，向收集的单核细胞中加入1mL KBM502培养基，用血细胞计数器计数细胞。如上述步骤操作得当，从10ml全血中可获得超过5×106个单核细胞。

       10) 用D-PBS制备浓度为10μg/ml的抗人CD3抗体溶液。将抗人CD3抗体溶液加入6孔板中，浸泡每个孔表面，在 37℃ 5% CO2 培养箱中孵育至少30分钟（Thermo Scientific HERAcell 150i CO2 培养箱已由HERAcell 150i取代)。

       11) 从培养板移除抗人CD3 抗体溶液，并用D-PBS缓冲液洗涤一次。

       12) 间收集的单核细胞溶液以2.5×105个细胞/cm2 的密度接种在抗人CD3 抗体包被的6孔板上，用KBM502培养基中，37℃ 5%-CO2 培养箱中孵育3-7天，不更换培养基，直到T细胞达到70%的融合度。

【注：Keiichi Fukuda研究团队2012发表于Nat Protoc的“Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus”因无法查阅，以上操作流程引自该团队2015年在J Vis Exp发表的“Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions”】

1.2 PBMCs重编程诱导为iPSCs

       使用CytoTune-iPS 2.0 仙台病毒重编程试剂盒对PBMCs进行重编程。

       感染24小时后，将感染的细胞以每皿1.25×105个细胞的密度转移到含有丝裂霉素C（mitomycin C, MNC)-灭活小鼠胚胎成纤维细胞（MEF滋养层细胞)的六孔板中，并以1：1比例MNC 培养基/hiPSC组成混合培养基一起孵育24小时。

       感染48小时后，用 hiPSC 培养基替换培养基，每隔一天更换培养基。

       iPS 集落在第 12 天后出现。一旦出现，就替换 Essential 8培养基培养，并传代到无滋养层培养系统(Life Technology)上。

1.3 iPSC分化为GINs和腹侧前脑类器官

1) iPSCs维持和传代

       sMDD iPSC和CTRL iPSC系用E8 培养基(Life Technology)维持在Vitronectin‐coated (Life Technology)板上，每天更换一半 Essential 8 培养基。

       培养基直至iPSCs集落达到70%融合度时（每隔5天，用Nikon Eclipse TS100倒置相差显微镜观察确认)，用温和细胞解离试剂(Stemcell，1 ml/孔)消化菌落1分钟，然后将细胞重新接种到六孔板中。

2) 神经细胞分化

       在神经分化过程中，iPSCs集落先在1 U/mL 分散酶（Life Technologies)中孵育2分钟，然后被分离形成胚胎体（embryonic bodies, EBs)。胚胎体随后悬浮在神经诱导培养基(neural induction medium, NIM)中，持续7天。

       第7天时，将胚胎体附着在含有8-10%胎牛血清（FBS)的神经诱导培养基（NIM: 500ml F12 + 5ml N2 + 5ml NEAA)的六孔板中，持续8-10小时，并每隔一天更换一次纯NIM。

       第10天，可以观察到玫瑰花结（rosette)结构【注：分化的细胞表达了神经干细胞特异的标志物Sox2（红色)和Nestin（绿色)，在贴壁培养状态下呈现极化的玫瑰花花环状排布，称为玫瑰花环。这实际上是神经干细胞形成的神经管样结构】。第16天时，用1mL移液管轻轻分离含玫瑰花结的集落，并将解离的片段悬浮在含有B27（Life Technologies)的NIM中。在悬浮培养物中，从第 10 天到第 25 天总共添加了 1.0 μM SAG，目的是将干细胞向GABA前体细胞分化。第 25 天后，每隔一天更换一次 NIM 培养基。

       第28天时，用TrypLE（Life Technologies)将神经球解离为单细胞后，孵育6-8分钟。随后，单细胞悬液以30000-50000个细胞/cm2的密度接种在Matrigel (BD Biosciences)和poly-l-ornithine（Sigma)预包被的盖玻片上，以进一步分化神经元【注：细胞计数Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set可由Countess III细胞计数仪Countess细胞计数板 C10228替代】。

1.4 腹侧前脑类器官的生成

       对于腹侧前脑类器官的生成方法描述为：“We generated ventral forebrain organoids by adapting our previously established method (Yuan et al, 2020). In total, 1.0 μM SAG was added from day 10 to day 25 in the suspension culture. After day 25, NIM medium was changed every other day.”【在悬浮培养物中，从第10天到第25天总共添加了1.0 μM SAG。第25天后，每隔一天更换一次 NIM 培养基。】

而所参考的Yuan等人的论文（2020、2023两篇文章的通讯作者为同一人)中相关内容为：

       To more systematically test the role of LHX6 in migration, we used fused forebrain organoids to determine the GI migration from ventral to dorsal. Cerebral organoids and ventral MGE organoids were generated from hPSCs by following the reported protocols with slight modification, which mimic the endogenous developmental environment more closely than 2D culture (Birey et al., 2017). To induce region-specific brain organoid, cerebral organoids were generated by default and ventral forebrain organoids were patterned with SAG, respectively. After 60 days culture from hPSCs, the cerebral organoids exhibited multiple cortical layer-like structures, with expressing cortical markers PAX6, TBR1, CTIP2, as well as neural progenitor markers SOX2 and NESTIN. 5 weeks old ventral forebrain organoids expressed NKX2.1, GABA and GAD67.

       在该文“补充材料”中给出了腹侧前脑类器官的生成方法是“Forebrain organoids culture and organoids fusion)”：

       For organoids culturing, embryoid bodies (EBs) were continuously cultured in neural induction medium (NIM) till day35 or longer time. For dorsal organoids patterning, hPSC derived organoids were cultured under spontaneous condition. For ventral organoids patterning, 500nM SAG was added from day 10 to day 25. Ventral organoids were infected with GFP lentivirus. To fuse dorsal and ventral organoids, one single dorsal organoid and one single ventral organoid were placed together in one 1.5ml EP tube at 37°C in a 5% CO2 incubator. After three days, fused organoids were fixed with 4% paraformaldehyde (PFA) for further analysis. For each group, n≥5. GFP+ Cells in ventral organoids were divided into two groups by the length from the soma location to the dorsal organoids’ border line(<100 μm and ≥100μm,respectively). Cell numbers in this two groups were counted for quantification. ^[3]

       综合起来，腹侧前脑类器官生成方法应是这样的：

       为系统测试LHX6在GINs从腹侧到背侧的迁移过程中的作用，采用先分别生成背侧脑类器官（Cerebral organoids)和腹侧MGE类器官（ventral MGE organoids)两个脑区特异性类器官，再经二者融合成前脑类器官模型。两个脑区类器官是“是遵循Yuan等人2020年报告的方案并进行了轻微修改后从hPSC生成的，它比2D培养更接近内在发育环境（Birey等人，2017年)。”

1.4.1 背侧脑类器官的生成

       胚胎体(EBs)在神经诱导培养基(NIM)中连续培养至第35天或更长时间（在自发条件下培养，不经慢病毒转染)。

1.4.2 腹侧MGE类器官的生成

       胚胎体(EBs)现在神经诱导培养基(NIM)中连续培养,从第10天开始到第25天，每日加入500nM SAG【注：SAG是一种有效的Smo受体激动剂，能够活化Sonic hedgehog信号通路，诱导神经元和神经胶质前体细胞的增殖而不影响新生细胞的分化模式，在背腹侧神经管发育中很重要】，并（在适当时机)用搭载GFP报告基因的慢病毒载体转染腹侧MGE类器官。

1.4.3 类器官组装体的生成

       分别将一个背侧脑类器官和一个腹侧MGE类器官放在一个1.5ml的EP管中，在37℃、5%二氧化碳的培养箱中培养。三天后生成融合型类器官用4% PFA固定，以便进一步分析。每组样本≥5。腹侧MGE类器官的GFP+细胞根据从体细胞位置到背侧类器官边界线的距离分为两组（<100μm 和≥100μm )，对两组细胞进行荧光计数分析。

       类器官培养过程质控：从hPSCs培养60天后，背侧脑类器官出现多个皮质层样结构，表达皮质标志物PAX6、TBR1、CTIP2以及神经祖细胞标志物SOX2和NESTIN。而5周龄腹侧MGE类器官表达NKX2.1、GABA和GAD67。

二、GABA能中间神经元相关抑郁症脑皮质类器官的表征方法

2.1 免疫细胞化学（Immunocytochemistry)

       将盖玻片上培养的细胞用含4%多聚甲醛(PFA)的PBS中在室温下固定30分钟，然后用PBS洗涤10分钟，共3次。

       将所有细胞在0.2% Triton X-100中透化10分钟后，用10%驴血清中封闭处理1小时。将一抗用含0.1% TritonX-100和5%驴血清的PBS稀释后，所有盖玻片与一抗缓冲液在4℃下避光孵育过夜。

       第二天，用PBS冲洗细胞，并与物种特异性AlexaFluor 488-、AlexaFluor 546-或AlexaFluor 647偶联的二抗（1/2000;ThermoFisher)，然后用Hoechst 33258染色以对细胞核进行复染。

       用Nikon 80i正置显微镜或Zeiss LSM-800激光共聚焦显微镜采集图像。

2.2 荧光图像的定量分析

2.2.1 GINs的分化率分析

       从sMDD组和对照组的每个盖玻片中随机选择至少9个视野，图像分析软件Image J对 GABA 和TUJ1阳性细胞进行计数【注：Tuj1抗体被证实仅识别神经细胞的Neuronal Class III β-Tubulin，不识别胶质细胞的β-Tubulin，被广泛用于神经细胞的免疫染色鉴定。】。

       生成了腹侧前脑类器官在第 30 天表达 GAD67、神经祖细胞标志物 SOX2 和腹侧前脑祖细胞标志物 NKX2.1。

2.2.2 单个GINss形态Sholl分析

       用Image J软件Sholl Analysis插件，以GINs的核为起点绘制多个半径相差10μm的同心圆。计算每个同心圆与GINs分支的交点数量、最大交点数和总交点数。sMDD组与CTRL组之间的统计差异通过单因素方差分析和嵌套t检验进行分析【注：Sholl分析技术由伦敦大学学院的Donald Sholl在1953年创建，用于定量分析神经元轴突和树突的方法。是将一组同心圆叠加到神经元胞体上，通过计算与每个圆相交的分支数，得出对不同区域的神经元树突和轴突的分支模式，从而定量表征神经元形态特征。】。

2.3 全细胞膜片钳记录分析（Whole-cell patch-clamp recordings)

       将盖玻片置于含有以下成分的浴液中：145 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES, and 5 mM glucose (280 mosM, pH 7.3)。

       神经元通过Olympus BX51WI型正置显微镜的60×水浸物镜观察。

       Digidata 1550B（Molecular Devices)进行数字化处理，通过Axon MultiClamp 700B differential amplifier (Molecular Devices)采集，并使用Axon Clampex软件（Molecular Devices)进行分析。电阻为6–10 MΩ的记录电极被填充了含有以下成分的细胞内记录溶液：130 mM K‐gluconate, 10 mM KCl, 10 mM EGTA, 2 mM MgCl2, 0.3 mM Na‐GTP, 2 mM Na‐ATP, and 10 mM HEPES (280 mosM, pH 7.3)。全细胞膜片钳记录在6–8周龄的GINs中进行。所有记录均在室温下进行。

       为验证 Trzd 处理后 sMDD GIN 的神经元活性，电生理实验发现 AP 的振幅和诱发的 AP 数随着 Trzd 的处理而降低，以及 AP 的半宽。此外，Trzd 治疗导致快速钾电流和钠离子向内电流与 CTRL 组相当。

2.4 钙离子成像分析

       在第 28 天将 GIN 和腹侧前脑类器官接种在涂有 Matrigel (Corning)的共聚焦培养皿上。钙成像实验在接种GINs后2周以内，腹前脑类器官附着后2-3天进行。

       在 37℃ 下用 1 μM Fluo-4 AM (Life Technologies)加载溶液处理GINs或腹前脑类器官15-30分钟，随后在室温下继续处理15-30分钟，并用 DPBS (Life Technologies)洗涤细胞。最后，将细胞置于制备成像的活细胞成像溶液中。

       用配备20倍物镜的Zeiss 800共聚焦荧光显微镜在 488 nm激发波长下进行单细胞尺度的钙成像。

       以 1 帧/3.2 秒的速度捕获时间序列图像。在成像开始后约1分钟，用高浓度KCL溶液（67 mM)刺激细胞。用Image J软件和Prism（v8，GraphPad)分析单细胞钙活性。在药物测试实验中，GINs先与NIM稀释的药物孵育5天，然后用Fluo-4 AM装载溶液处理，清洗后，在第40天进行活细胞钙成像。在药物处理实验中，GINs用10 μM Trzd处理5天，腹侧前脑类器官则处理7天。

       图像显示，sMDD组来源的类器官中钙离子信号上升幅度显著低于对照组比类器官的表现。

2.5 干细胞分化标记物实时PCR分析——验证sMDD 5-HT2CR mRNA表达的下调

       使用Trizol试剂盒（Life Technology Inc)分离RNA样品，并使用Goldenstar RT6 cDNA Synthesis Kit (Beijing TsingKe将每个样品中的1μg总RNA逆转录成cDNA。

       在20μl反应系统中进行实时PCR，其中包括2μlcDNA、1μl正向和反向引物、7μl ddH2O和10μl 2X SYBR Green RCR预混液（Vazyme)。GAPDH为看家基因进行归一化处理（qPCR 的引物序列见表 EV3)。扩增条件：变性（98℃ 10s)、退火（56℃ 10s)和延伸（72℃ 10s)，共40个循环。

2.6 Western blotting印迹——验证sMDD  5-HT2CR翻译水平降低

       将 GIN 在含有混合物的 RIPA 缓冲液 (Roche)中在冰上裂解 20 分钟（获得 20-30 μg 蛋白质)，并在含有SDS和 β-巯基乙醇的上样缓冲液中稀释。将蛋白质在 100℃ 下加热 8 分钟以使蛋白质变性后，将蛋白质加载到 10%分离凝胶中在 100V 电压持续70-90 分钟分离后。以 300 mA-100 分钟转PVDF膜。4℃下将膜用 5% 牛奶稀释的一抗中孵育过夜。第二天，倒出初级抗体，并用TBST洗涤膜3次，每次5分钟。然后将二抗在摇床上室温孵育 1 小时。孵育完成后，用 TBST 重洗膜 5 分钟 3 次。将鲁米诺底物溶液A和B按1：1的比例混合，并在暗室中加入到膜表面。采用 ECL 系统检测蛋白条带，即可获得蛋白质的表达量。 

2.7 转录组分析(Bulk RNA sequencing analysis)

       2.7.1 用 Trizol 试剂盒 (Life Technology Inc)提取总 RNA，并通过 Oligo (dT)珠子富集 mRNA，然后转录成 cDNA。

       2.7.2 Illumina HiSeq 2500平台完成文库构建和RNA测序。

2.7.3 数据分析：

       RNA-seq读段使用HISAT2（v.2.1.0)与人类参考基因组GRCh38和转录组进行比对。

       用DESeq2包（v.1.30.0)进行RNA差异表达分析，设定的截止标准为调整后的P值< 0.05，且绝对log2折叠变化≥1；

       用EnhancedVolcano包（v.1.10.0)生成的火山图展示上调或下调的基因数量；

       在Reactome在线平台上进行Reactome通路分析；

       用clusterProfiler包（v.4.0.2)进行基因本体（GO)分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG)通路分析；

       通过pheatmap包（v.1.0.12)生成的热图展示基因的表达情况；

       基于DrugBank数据库，在NetworkAnalyst网络可视化分析平台上分析药物与蛋白质靶点之间的相互作用。

对 CTRL 和 sMDD 样品进行了差异表达分析：

       在 sMDD 组中差异表达的基因与MDD的相关性最大，显示细胞模型概括了抑郁症和精神分裂症的转录组学特征。

       GSEA分析显示，GABA能神经元分化和钾通道活性相关基因表达的上调，而高压门控钙通道活性相关基因表达下调，表明 sMDD GIN 中的钙通道功能的变化。

       对所有 GIN 细胞重复聚类程序显示，eIN 和 mIN 细胞类型中子簇的UMAP可视化显示了六个 GIN 簇，CTRL和sMDD 样本中子簇的相对比例。sMDD神经元所反映突触成熟和可塑性的基因表达以及SYT1、SYT4、SYT11、SYP、GAP43对钙的反应下调，与之前观察到的 sMDD 组 GIN 功能受损一致。

       用 CellChat比较CTRL 和 sMDD 两组样本中不同 GIN 子集群之间相互作用的数量和强度后显示，sMDD 组中的 GIN 在几乎所有类型的配体-受体相互作用中都显示出相互作用次数减少和连接水平降低，尤其是在与 ECM 受体相关的相互作用中，这表明 sMDD GIN 感知和响应细胞外基质（如钙、生长因子和生物活性分子)的能力受损。

【注：考虑到为单细胞测序而制备单细胞悬液的热酶解过程，可能会诱导即刻早期基因（Immediate-Early Response Genes，IEGs，如Fos、Jun或其他激活蛋白相关基因)、转录因子、热休克蛋白（Heat-shock Proteins，HSPs)等基因激活干扰基因表达差异分析结果。为明确单细胞测序分析结果的准确性，可以分析单细胞测序数据和 Bulk RNA-seq 数据的表达相关性，评估组织单细胞数据是否受组织解离影响。若基因在两组测序结果中表达量接近，并且单细胞测序数据和 Bulk 测序数据整体相关性高，则表明单细胞测序整体上没有明显受到前期样本酶解的干扰。】

       为确认单细胞分析结果的准确性并更好地检测编码低丰度受体的基因的表达，本文对照组和轻度抑郁症（sMDD)组在分化5周后进行了bulk-seq 分析。

       用DESeq2软件包确定两组间发现了244个差异表达基因（DEGs)，其中65个基因表达下调，179个基因表达上调。

       GO富集分析显示BMP信号通路在sMDD样本中上调。

       Reactome通路分析提示，IL-4和IL-13信号通路在sMDD中也增强。

       KEGG通路分析显示，包括神经活性配体-受体相互作用和钙信号通路在内的通路减少，与单细胞RNA测序结果一致。

       结合DrugBank中的DEGs及其靶药物，构建基因-药物网络，并根据它们与药物诱导表达的接近程度对潜在药物靶点进行排序发现，HTR2C是DEGs中最富集的基因。

 【注：bulk RNA测序分析，即通常说的RNA-seq，转录组测序分析，广泛应用于全转录组水平分析差异基因表达和mRNA差异剪接、RNA翻译（translatome)和RNA结构组（structurome结构组学)和空间转录组学（spatialomics)等研究。】

2.8 单细胞RNA测序（Single-cell RNA sequencing analysis, scRNA-seq)

2.8.1 单细胞制备

       通过1ml trypLE (Life Technology)在37℃和5%二氧化碳的条件下处理30分钟，将体外分化35天的粘附性GABA能神经元解离成单个细胞。低速离心去除细胞碎片和其他聚集物；

2.8.2 文库制备

       文库制备：每个样本大约有5000个细胞被捕获到Chromium single cell 3′芯片(10X Genomics，PN-120236)上，每个细胞释放的RNA通过在乳化物中的单个凝胶珠中进行逆转录并条形码化；

       用Bio Rad的S1000 Touch Thermal Cycler在53℃下进行45分钟的逆转录，接着在85℃下处理5分钟后，4℃保温；

       cDNA的质量用Agilent 4200（Agilent Technologies)评估；

       scRNA-seq文库用Chromium single cell 3′Library & Gel Bead Kit V3建立。

2.8.3 mRNA测序

       在Illumina NovaSeq6000上以每个细胞至少750000个读取的测序深度进行测序。

2.8.4 数据分析、可视化和解读

       原始测序数据用Cell Ranger软件3.1版（10X Genomics)处理，生成FASTQ文件，并使用GRCh38人类参考基因组进行比对。用Cell Ranger结果中的基因表达矩阵，通过R 4.1.1进行后续分析；

       通过Sctransform方法进行归一化处理，以去除每个Seurat对象线粒体映射百分比的变异；

       数据集的整合也通过Seurat中的整合函数来校正批次效应。用PCA进行降维，前40个主成分用于生成聚类，采用K-means算法和基于图的算法；

       UMAP图展示了单细胞转录组谱型的可视化，使用Louvian模块优化算法对相似细胞进行聚类。利用已知的细胞标记基因来注释不同的生物细胞类型。Seurat中的FindMarkers功能在默认参数下用于识别不同样本间的DEGs。通过PsyGeNET数据库评估已识别的DEGs与已知精神疾病之间的关联。用fgsea（v.1.18.0)进行GSEA分析；

       VoxHunt（v.1.0.0)用于单细胞转录组的无偏空间映射；

       CellChat（v.1.1.3)显示不同GABA能神经元亚群内和之间的所有已知配对的配体和受体，评估潜在的细胞间通信。

       单细胞测序可对同一类型细胞的不同功能状态、细胞构成进行分析，并能够消除Bulk测序中细胞异质性问题。

       为了检测转录组谱型的变化，对NC3-1和SA005-1细胞系进行了单细胞RNA测序。提取所有GINs细胞，单细胞RNA测序每个样品中有3000多个细胞，采用与GINs发育相关的每个高表达转录因子定义亚簇。UMAP分析根据已知细胞类型标志物的表达确定了五种主要细胞类型，包括周期细胞［注：周期细胞，即cycling cells, CyC。CyC亚群细胞高表达一些与细胞周期相关基，而被单独聚成一群，其中包含多种细胞亚群］、神经元干细胞（neuronal stem cells, NSC)、腹侧神经元祖细胞（ventral neuronal progenitor cells, vNPC)、早期中间神经元（early interneurons, eIN)和成熟的中间神经元（mature interneurons, mIN)。由此而确认体外生成的细胞主要是源自MGE的基因异质性神经元及其前体细胞。

       将 scRNA-seq 转录组映射到 Allen Brain Atlas 上显示，GINs与E13.5小鼠大脑的腹侧前脑相似。与 BrainSpan 数据库的比较显示与神经节隆起区域的相关性最高。故确认体外产生的细胞主要是MG来源GINs及其祖细胞。

       对sMDD GINs的转录分析发现，细胞外基质配体-受体相互作用减少，提示HTR2C表达缺陷。

参考文献：

[1] Kaiqin Lu, Yuan Hong, Mengdan Tao, et al. Depressive patient‐derived GABA interneurons reveal abnormal neural activity associated with HTR2C. EMBO Mol Med. 2023; 15(1): e16364.

[2] Yoshikazu Kishino, Tomohisa Seki, Shinsuke Yuasa, et al. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions. J Vis Exp. 2015; (105):53225.

[3] Fang Yuan, Kai-Heng Fang, Yuan Hong, Shi-Bo Xu, Min Xu, Yufeng Pan, Yan Liu. LHX6 is essential for the migration of human pluripotent stem cell-derived GABAergic interneurons. Protein Cell. 2020; 11(4):286–291.