关注“无辜样本”保护——在短暂室温下挑管操作后再返回低温环境（-150℃以下）时样品的持续升温

资料来源：2015年International Society of Cellular Therapy年会报告摘要

原作者：Julian Warhurst, John Fink, Tiffany Holmes, Matthew Albert, Bruce Zandi.

编译：阿拉斯加科技(北京)有限公司

一、引言

       学界普遍认为，将生物样本储存在-190℃的液氮气相（LN2 vapor-phase）中是最理想的长期保存方案。然而，在对液氮储存样品管理操作期间，总有部分非工作使用样本，因同一个冻存架中其他目标样本管的分拣等操作需要，被从液氮环境中移出，从而暴露于实验室高温环境。作者将这部分样本称为“无辜样本”。实际工作中，“无辜样本”在其整个存储周期内，可能会经历无数次这样的操作。特殊情况下，甚至可能这一过程中因温度波动过大而造成样本活性受损。通过实验来模拟样品存取操作条件，了解从-190℃液氮气相储存罐中取出样本的频率、时长与样本温度变化间的规律，制定和完善样本存取操作规程，可确保样本温度达到保存质量控制标准。

二、方法

       储存温度控制标准：以水玻璃化转变温度（Tg= -135℃）作为温度波动最高阈值。

       实验材料与设备：2mL FluidX冻存管，10×10个冻存盒，14层液氮罐冻存架。

测试方法：冻存架通过专用机械装置从液氮气相储存罐中取出，避免了人工操作产生的主观差异，确保时间记录的统一性。整个过程中，冻存盒或冻存管均未被触碰或移出冻存架。

       每次测试中，先将样品在-190℃液氮气相环境下充分平衡并达到稳定。精密热电偶温度探头放置在冻存管内的中心位置，在整个升温过程中以2秒间隔记录不同时间点时的样品温度。

       测试条件设定：每个冻存盒里放置三个冻存管，其中两管分别位于冻存盒的2个角，另一管置于冻存盒正中心位置。冻存盒的角落有两面暴露于外界高温环境，而其周围缺少其他冻存管提供绝热保护。因此，角这一位置是冻存架上温度受影响最大的部位。实验中，设定了一个“条件最恶劣”冻存盒，内部仅有三个冻存管，放置在14层冻存架顶层位置，不仅位置最接近储存罐顶部空间，且盒的上下都没有其他冷冻盒保护。作为对比，另一个装有10×10个冻存管的冻存盒被放在冻存架中间位置，并使其上下都有满载冻存盒。

三、结果

       首次测试时，将冻存架从液氮冷冻室取出30秒后立即返回液氮罐，观察最上层冻存盒中一个角的冻存管内温度变化。测试结果见图1。垂直虚线线标示了冻存架重新放回冷冻室的时间点。                                              

       虽然只是将冻存架取出后在室温下停留短短30秒钟，但位于冻存盒角落的冻存管内温度及升至-170℃。需要特别注意的是，在冻存架重新放入-190℃环境后，管内温度仍然持续升高了2.5分钟。这是因为当取出装有冻存盒的冻存架时，架的升温度幅度远超架内部的冻存管。冻存管重新放回液氮罐后，依旧保持与冻存架、冻存盒间的热交换而升温。直到冻存架重新放入液氮罐2.5分钟后才开始降温。温度记录显示，冻存管在液氮储存罐外暴露期间的温度累计上升了7℃，而在重新放回液氮储存罐后还继续升高13℃之多。

       在第二个测试中，对同一冻存管样品进行了四种不同时间室温暴露处理，以模拟实验室可能的不同标准操作程序。数据显示，冻存架取出2.5分钟和3分钟后，架顶部冻存盒角落管内样品温度达到或超过-135℃，且在冻存架返回液氮罐后仍然继续保持高于初始温度的状态。冻存架取出3分钟时，温度峰值出现在插入后2分钟，达到-122℃，高于控制阈值Tg。

       第三个测试实验中，观察了放置在14层冻存架中心位置、装满样品的冻存盒一角的冻存管，在四种不同持续暴露时间下，内部温度的变化情况。结果显示，管内峰值温度明显低于预期（见图3）。暴露时长为3分钟时，冻存管返回后温度峰值为-152℃。这表明，冻存架在温度不超过Tg情况下，最多可耐受在室温下暴露时间为6分钟。

       第三次测试堪称理想场景，因为冻存盒和冻存管都有近邻可提供良好的隔热效果。一个重要的发现是，当完全填充冷冻盒中的冻存管放回液氮储存罐后，恢复到-190℃所需的时间很长。在制定样品存取标准操作流程时，须考虑这种缓慢复温效应，以便评估实验架从液氮储存罐中取出操作频率的控制。

       在第四次测试了两种不同冻存盒样品管装载密度下，处于角落位置的样品管与冻存盒中心样品管的内部温度表现。结果显示，冻存盒未充分填充样品管时，角落和中心位置的管内温度变化相似（见图4）。这是因这两个样品管都缺少邻近样品管作为隔热屏障所致。相比之下，图中底部两行显示，冻存盒内完全填充样品管时，盒角落的冻存管明显比和中央冻存管升温快。请注意，位于盒中央的冻存管在冻存架放回液氮冷冻室约25分钟后才达到峰值温度，而且在很长一段时间内都保持在高于-190℃的储存温度。

       下一步的实验评估了冻存盒内装满样本时，位于角落的冻存管在取出3分钟后立即放回冷冻室时，恢复至初始温度所需的时间。结果显示：冻存管最终恢复至初始温度耗时竟长达3小时（见图5）。

       假设冻存架在返回到液氮冷冻室1小时后被再次取出，样品将比最初取出时温度高 5℃。如果冻存架在一天内可能被多次取出，操作规程必须考虑并补偿这一温升差异所带来的影响。冻存架在第一次拉出时，管内温度可能不会超过Tg。但一天中的第三次或第四次取出时，则可能会超过 Tg。

       一个意想不到的发现是，实验室内空调通风口对样品升温的不利影响。在完全填充的冻存盒角落的冻存管，当关闭房间空调通风口时，样品升温速率提高了50%（见图6）。

       而将冻存架放入泡沫保温套中，则可改进这一情况。这种看似微小且容易被忽视的（a seemingly minor and overlooked factor）因素——暖通空调带来的气流循环，竟然对置于冻存架和冻存和内部样品管的升温速度产生如此显著影响。这提示，在实验室操作规范中，人们必须考虑并校正这些因素。

四、结论

       研究发现，样品液氮气相储存操作中，样本管在冻存盒中的位置、冻存盒在冻存架中的位置及上下位置是否有近邻冻存盒，冻存盒内冻存管填充数量，都会显著影响样本的升温速率和最高温度。

       “无辜样本”在冻存架取出135秒后可能升温超过玻璃化转变温度（Tg）。而此后需要数小时才能恢复到-190℃的初始温度。若实验方案中未对这些因素进行规划和补偿，可能导致这部分“无辜样本”无法避免升温到Tg以上的安全阈值。

       因此，对于液氮气相储存样品日常存取操作，提出以下实践建议：

       1）尽量缩短样品在冷冻室外暴露的时间。

       2）避免在冻存盒中放置空冻存管。周围放置的冻存管能提供显著热屏障，从而减少暴露时的升温。建议每个样品管周围空位都用以水填充的空白冻存管填充。

       3）避免或尽量减少实验室内的直接气流或冷暖空调的暴露。

       4）如果可能，将取出的冻存架适当加以遮盖保护，以阻止室内热空气对流活动。

       5）精准控制记录样本架进出冷冻室的时长，并估算无害化处理样本的最终温度。由于人员可能多次取用同一样本架，需特别注意避免样本温度超过玻璃化转变温度。