低氧细胞实验中三气培养箱氮气使用有效管理问题的解决方案——下

 （前续：低氧细胞实验中三气培养箱氮气使用有效管理问题的解决方案——中 ）

三、低氧细胞培养实验中三气培养箱经济平稳运行的解决方案

       三气培养箱本为O₂治理而生，而为此付出代价最大的却是N2，还捎带上了CO₂。两种气体各自消耗量还因O₂浓度设定值而异。如三气培养为间歇性运行，在O₂含量5%设置条件下，每次仪器重启初始化进程所消耗的CO₂气体流量约为同等工作容积CO₂培养箱所消耗量的10.5倍。而低氧运行维持期间，因这两种气体的消耗速度相差悬殊而气瓶更换频次不统一且随O₂含量控制要求而变化。对设备管理者而言，多人共享三气培养箱的情况下，要判断N₂钢瓶中余量液氮是否能有效应对下一步低氧实验要求，需提前储备多少气瓶方可高枕无忧，这显然极为困难。而实验者则需对两种气体，特别是N₂的“高消费”开支做足思想准备。

       既要确保低氧细胞实验运行中N₂稳定供应，又要有效降低实验中N₂消耗，这是众多细胞培养实验者必须要面临的问题。而三气培养箱国外制造商为低氧实验的可靠实施，提供了多种类型与N₂管控有关的工作附件选项，的确具有重要实用价值。

3.1 气瓶自动切换器

       气瓶自动切换器（Gas tank changer）是一种能够为气瓶无缝切换供气而开发的简便装置。其功能设计类似于三通阀：有2个输入端口和一个输出端口。两个输入端口分别连接2个同种气体的气瓶（CO₂、N₂或 O₂），可实时监控供气瓶的气压。输出端口则可与一个或多个培养箱连接。

       当第一个气瓶中的气体耗尽时，它将自动切换到第二个备用气瓶供气。当备用气瓶的气体也将耗尽时，装置会发出声光报警提醒用户更换气瓶。三气培养箱配置气瓶自动切换器后，实验者无需在气瓶处于低压运行期间时刻紧盯气压表和并随时准备更换气瓶，即避免有效气源的浪费，更有利于实现N₂供气管理的长治久安。

       气瓶自动切换器分为外置（External gas guard）和内置（Built-In Gas Guard）两种。

       内置自动切换器与主机电源和控制系统连接，为出厂预装组件，需在订购三气培养箱时定制。

       外置自动切换器则可由专业人员在用户现场安装，不仅功能强悍，且布署十分灵活。装置同时连接一主一副两个气瓶，并有指示灯指示值班气瓶。当主气瓶中气体用尽，装置将自动启用备用气瓶供气。切换器和主副气瓶可以远离培养箱的位置布置，譬如安装在细胞间外，通过专用气路为一个或多个不同品牌、不同型号的三气培养箱同时供气。外置自动气瓶切换器既可用培养箱原厂选件，也可以使用第三方产品，升级维护方便。

       当然，无论是内置、外置气瓶自动切换器，都是为了确保箱体供气的稳定性，并不能解决气体消耗量大的问题。而要切实降低三气培养箱低氧实验运行中的N₂消耗开支，还得靠箱体配套的分割式气密型内门装置。

3.2 分体式内门

       既要确保低氧细胞实验运行中N2稳定供应，又要有效降低实验中N2消耗，这是众多细胞培养实验者流量是指流体在单位时间内通过某一横断面的容积（或重量），可用L/min标示。流速是流体体通过截面积的速度。流体在一定时间内通过特定截断面的体积与流体的速度和截断面面积成正比。

       细胞培养箱若采用传统一体式单一内门，则每次存取样品开启内门后，整个机箱内部全部暴露于实验室空气中。箱体内外气体温度和浓度差异悬殊，箱内高温气团迅速向外扩散、向上蒸腾逃逸。温度较低的空气通过对流迅速流入，由下而上填充到箱内的自由空间，完成对箱内工作气体的置换。机箱正面开孔尺寸大，相当于发生气流对流的截断面面积大，热气团向外扩散自然更快，损耗工作气体容积越大。以普和希品牌三气培养箱为例，MCO-50M箱内正面截面的面积约1420cm2，而MCO-170M内部截面面积约3250cm2，是前者之2.3倍。如限制箱内外冷热气体对流通道截面面积，则可减少气体对流的损耗。因此，人们在选择三气培养箱时，往往倾向于选择Prescyto MG-71M、MCO-50M这类工作容积较小的机型。而对于多人共享培养箱服务平台，小容量培养箱内部工作空间有限。多个实验项目的不同实验样品混杂，在操作中容易发生交叉污染。

       分体式内门（Multiple-split inner door, or inner door with Multiple-segments），又称分割式气密性内门（Gas Tight Screen Door），是替代传统一体式玻璃内门的密封装置。每扇小门对应于培养箱一个隔层空间，各小门独立开合，互不干扰。存取样品时，只需开启其所在隔层对应小门，而其它隔层的小门依然处于密闭状态。因此，不会因少量样品存取操作而将箱内所有空间样品暴露，箱内气体外泄发生被严格限制在局部范围，有利于保持细胞培养环境稳定，降低了N₂、CO₂、O₂和水蒸气浓度大幅波动和气体泄漏。理论上，内门数量多，则样品操作中箱内培养气体环境波动小。

       分体式内门又分为一层一门和一层左右两门两款。eppendorf CellXpert C170i三气培养箱有单一内门型、4分内门型和8分内门型三种机型可选。8分内门是在4分内门结构基础上，将每个小门进一步划分为左右两扇小门而来，密闭防护效果比四分内门更优。再如Thermo HERAcell VIOS 160i三气培养箱，内部工作空间分为三个隔层，有单一内门基础款和配置3分内门多人共享版。而蜂巢式HERAcell VIOS 160i三气培养箱虽然也是三个隔层，但标配6分式气密内门，将箱内空间隔断成6个独立培养小室，可供6个实验者可自独享一个小室。这样还使不同样品交叉污染风险降低，方便共享管理。

       多屏分割式内门可以在订购三气培养箱时作为O₂控制系统组件之一定制和工厂安装，也可以在单一内门使用中升级安装。

       分体式内门装置降低的是开门操作工作气体的损耗。但因每日经箱体通气口泄漏流失的气体体积远大于箱门启闭次数受控条件下所致损耗。因此，如要实现低氧培养实验中N₂供气无忧管理，还得仰仗氮气发生器帮忙。

3.3 氮气发生器

       当低氧培养箱内部容积高达170L以上，或培养过程中需频繁开门操作样品，甚者实验室有2台三气培养箱在工作，则N₂的消耗将成为一项巨大管理支出。

       此外，对于仪器公共服务平台，因不同O₂浓度控制条件下的低氧实验对CO₂、N₂消耗速度不同，传统以仪器使用时长为依据的计费服务管理方法就不合时宜。而引入氮气发生器，可将N2消耗量差异的矛盾就转变为氮气发生器工作时长问题，对平台和实验者双方而言，都具有重大经济价值。

       LC-MS等诸多分析仪器运行通常需要耗费大量分析级高纯度氮气。用实验室氮气发生器现场制氮而非氮气钢瓶为LC-MS分析实验供气，是全球多数分析仪器平台的通行做法。

       氮气发生器将室内空气经多级过滤去除气体中的灰尘颗粒和水分后，用空气压缩机将空气泵入中空纤维膜滤除氧气，即源源不断产出99.99 - 99.999%纯度的高纯度氮气。

      发生器外形小巧，一键式操作启动制氮。工作人员无需反复移动钢瓶，无需负担传统N₂气瓶运输和租赁成本，就解决了气体稳定供应的问题。

       据已有测算数据，170L的三气培养箱在5% O₂条件下连续运行期间N2日消耗量约351L，而完成初始化所需输入的N₂体积为400L。如要在20分钟完成开机初始化过程，则此间N₂输入流量须达到20.0 L/min。而稳定运行期间所需的N₂流量仅0.25L/min。低氧维持与开机初始化进程所需输入流量相差数十倍之多。
       无论国产进口氮气发生器，在产气纯度达到99.5%的工业N₂标准或99.99%《医用气体工程技术规范》中规定N₂纯度标准情况下，氮气发生器的产气流量与三气培养箱开机初始化最大N₂输入流量的匹配应作为选型的主要参考指标。

表4 三气培养箱配套氮气发生器技术规格实例

       表4的信息表明，日本TAITEC 公司所提供的N₂ GENESIS 200 + GST-0205M组合套装，在N₂纯度99.5%时最大输出流量为3L/min，用于维持50 - 170L培养箱内环境维持5% O₂低氧水平是可行的。据测算，53L容积箱体在5% O₂设定条件下开机初始化进程需N₂体积约130L，若要在30分钟类完成则氮气发生器有效气体输出流量至少应达到4.4L/min。但这套氮气发生器组合方案，视乎勉为其难。
       反观日本PHCBi 公司的HF30氮气发生器，其99.5%纯度N₂输出流速高达32L/min，完成MCO-170M三气培养箱开机初始化所需400L气体制备，耗时仅12.5分钟，执行效率相当可观。

       可见，50L容积三气培养箱配套的氮气发生器，99.5%纯度N₂输出流量应》5L/min。170L容积箱体完成5% O₂浓度条件的初始化所需N₂输出流量应》14.1L/min，完成1% O₂条件初始化则要求N₂输出流量》53.6L/min，则32L/min的输出流量都显得捉襟见肘。。
       通常，氮气发生器系统的售价随产气流速增大而升高。在预算有限条件下，有效控制氮气发生器系统造价和提升产气流量两种需求之间是矛盾的。而采用氮气发生器配置压缩气瓶的方法，可一定程度上实现氮气发生器流量成本控制与高峰期大流量N₂输出需求两个矛盾的平衡。将5-30L/min中小流量氮气发生器+10-20L压缩气瓶组合后用于为三气培养箱供气，是较为理想的解决方案。

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