从水面蒸发自然规律探析微量紫外可见光度计使用中移液体积有效控制问题

    本文从水汽蒸发的规律出发，探讨了超微量紫外可见分光光度计类仪器实际应用中发现的测试误差、稳定性问题产生的可能原因，并从测试样品体积调整、移液器的选择和点样操作时间控制三个方面提供了建议。

一、自然界水汽蒸发的基本规律

       自然界，液态的水从液面、固体表面转变成气态并扩散进入大气的过程，称为水的蒸发^[1]。我国学者综合了蒸发面的饱和蒸汽压差、水面风速、空气相对湿度和环境气温4个主要影响因素后，在描述水蒸发规律的经验模型——道尔顿公式基础上，建立了自由水面蒸发速率（或水日蒸发量，用E表示）的计算公式 ^[2]，即。

E = (e₀- e₁₅₀) • f(W) • [c + d(1-U²)^0.5] • f(T₀-T₁₅₀)

       水面蒸发速率的单位为mm/d。1mm/d代表单位面积上的日蒸发液体高度为1mm。

       其中：

       水汽压是指空气中汽态水的分压强。饱和水汽压则是指在一定温度下、一定体积空气中，水汽达到最大限度含量时的分压强。温度升高，能使原已处于饱和状态的空气变得不饱和，还能进一步容纳更多的水汽，蒸发面上的蒸发重新出现，则饱和水汽压因而随之增大。e₀指水面饱和水汽压强，e₁₅₀代表水面上方150cm高度空气的饱和水汽压强。二者之差（e₀- e₁₅₀）为饱和水汽压差。饱和水汽压差越大，蒸面发面上蒸发作用越强。

       f(W)为风速函数，W代表水面上空150 cm 处风速。水面风速可加快空气中水汽的扩散和输送，使水分子更容易逸出水面，蒸发加快。风速大，即f(W)值大。

       U为空气相对湿度，是某一温度下空气中的实际水汽压与该温度下空气饱和水汽压的比值。相对湿度较小时，水汽向外扩散和交换较快，蒸发作用较强。

       f(T₀-T₁₅₀)为温度函数，T₀、T₁₅₀分别指代水面、水面上方150 cm高处的气温。通常，水体温度升高并高于T₁₅₀会加大蒸发速率。

       由道尔顿蒸发定律可知，水面上方空气相对湿度小、水面风速大、水体温度高，可增大自由水面水蒸发率。这在用氮气吹扫仪进行样品浓缩时很容易体验到：增大高纯度干燥氮气流量、采用加热模式可增加水等溶剂的蒸发速率，提高样品浓缩效率。而PCR、实时荧光定量PCR实验中则特别注意反应孔的密封。因反应体系水分蒸发，将造成样品孔内反应组分浓度失衡，会破坏各孔扩增均一性，甚至使PCR失败。

       不同地域和季节，实验室的室温、通风对流条件、空气相对湿度不同，水汽蒸发对实验样品影响的直观程度不一。

       譬如，蛋白凝胶、转印膜、新鲜组织等样品长时间直接暴露于空气中，水分大量蒸发对实验潜在危害的防范意识已深入人心，人们通常会采取保湿保鲜处理措施应对。微量紫外可见光度测试操作中，上样体积通常不过数微升，点样后放下检测臂，20秒时间不到即可自动完成测定和结果显示，操作简单便捷，并不存在可影响到样品测试精度和稳定性的繁文缛节。其实，微量紫外测定操作与水分蒸发之间，看似微不足道，实则关系重大。                                              

       NanoDrop类微量光度计与NanoPhotometer N60超微量紫外可见光度计对体积2.0µL以下样品常规浓度样品测试光路生成所用方法完全不同（详情可参考《Implen NanoPhotometer微量紫外可见光度计隆重上线》）。美国NanoDrop为代表的微量紫外分光光度计的测试光路的形成及有效维持取决于两个关键因素：一是疏水性石英光学表面对样品的低吸附性，二是样品中水的表面张力作用。此二者共同作用可确保滴加到检测窗表面的液滴自动收缩形成饱满圆珠。一旦光学表明因样品污渍、盐分、表面活性剂等残留，点样后液体无法形成半球型微珠，测试系统的稳定性和可靠性将不复存在。

       而液体圆珠的生成后，随之而来便是水汽蒸发与样品浓缩的问题。

二、超微量紫外可见光度计测定中的样品浓缩问题

       比表面积（specific surface area）是指物体表面总面积与其体积之比值。

       在材料科学、化学工程等领域，通常，粒子越细，比表面积（习惯上用单位质量物料所具有的总表面积标示，单位m2/g）越大。粒子物化活性，如氧化、溶解、蒸发、催化以及生理效应等都因细粒子比表面积大而加速。生物学中，细胞的比表面积影响细胞物质交换和代谢功能。小细胞通常具有较高的比表面积值，它们能够更有效地从外部环境中摄取所需的养分并排出废物。

       根据几何学常识，在体积相同条件下，与圆柱体、椭球体、正方体比，球体的表面积是最小的，因而球体的比表面积也最小。

       自然界中，露珠一般形成于温湿度适宜、晴朗无风或微风的夜晚，而随着清晨气温升高和气流携带水汽加速扩散作用，很快会因蒸发而消失。因所附着物体表面及位置不同，露珠往往呈球形、半球型或水滴状。

       球体体积=4πR³/3，故半球体的体积为2πR³/3。

       球体表面积=4πR² ，则半球体的曲面部分的面积＝2πR²。

       将半球体的曲面表面积与半球体积（露珠或超微量测试样品的容积）的比值视为半球体比表面积（等效于单位体积液体所占曲面表面积，单位为m2/µL），该比值=3/R，它与半球半径成反比。液体体积增加，半球直径加大，半球曲面比表面积降低。

表1 半球体积-半径-曲面比表面积表

       譬如，半球体积（相当于露珠或测试溶液体积）从2.0µL增加至4.0µL时，半球半径增至原来的1.26倍，而半球曲面比表面积反而降至原来的0.79倍。

       将表1中半球球体体积(x轴)与曲面比表面积（y轴）作图可得到半球曲面比表面积随半球体积变化曲线。图3中，比表面积曲线在0.5 – 2.0µL体积区间呈现为急剧俯冲下降段，2.0µL是一个转折点，此后的曲线相对平缓，其中2.0µL – 5.0µL体积区间下滑坡度略大，5.0 – 10.0µL体积区间比表面积降幅收窄、降速减弱。

       水溶液直接暴露于空气中，存在水分蒸发问题。在自由水面，蒸发速率相同条件下，半球体积大，半球曲面总表面积大，则相同时间内因蒸发损耗的水汽绝对体积固然更大。但曲面比表面积曲线则告诉人们：半球体积较小，曲面比表面积反而较大，则相同时长内液体蒸发速率更高，单位体积液体的浓缩作用越明显。因此，存在这样一种事实：半球形液体体积少——单体液体曲面比表面积大——单位体积蒸发速率大——单位体积液体蒸发量大——溶液浓缩效应大。简单概况起来就是，半球体积小，液体浓缩程度大。

       测试样品因水汽蒸发所致浓缩效应对测试结果的影响，在常规比色皿测定中可能不明显，但对于NannoDrop One C这类超微量紫外可见光度计，单样品上样体积仅2µL的测试操作，浓缩效应对测试结果的影响清醒则蔚为壮观。而为减少小体积样品测试结果因水汽蒸发样品浓缩所致测试误差，适度增加上样体积不失为一个有效应对方案。

       从图3看，2.0µL – 5.0µL体积区间具有较高效（比表面积）费（样品消耗体积）比。相对而言，5.0µL – 6.0µL体积较2.0µL更理想。故有业内资深人士吴铁坤先生曾建议，NannoDrop系统单个测试样品的点样体积以5.0µL为宜，看来颇有见地。

       NannoDropOne C代表的微量紫外可见光度计的测试光学原理基本一致，即点样后在检测基座和检测臂光学表面半球形液滴转变为一条垂直液柱，测试光路从液柱的中轴穿过来对样品检测。NannoDropOne的测试光程介于0.030 - 1.0 mm之间。而从表1可知，0.5µL - 2.0µL体积样品的半径介于0.62 - 0.98mm之间，当测试光程为1.0mm时，液滴由半球体被轻度拉伸为垂直液柱并且在8秒钟测试期间维持不变。因半球体转换为柱体后，液体表面积增大的同时水汽蒸发速率随之增加。

       而点样体积达到3.0µL后，液滴半径增至1.13mm以上，其自然半径和高度足以充满上下光学界面空间。检测臂放下后无需拉伸液滴即可自然形成稳定有效的检测光路。此时，液体呈不规则半球体状（近似于椭球体），曲面比表面积值变动程度细微到可以忽略，故样品在测读期间，水汽蒸发速率依然维持在较低水平，浓缩问题得以较好控制。

       正是基于降低此类型仪器平台测试运行期间样品水汽蒸发的考虑，为确保测试运行可靠稳定，微量紫外可见光度计对测试环境的温度（5 – 35℃）、空气相对湿度（20-80% R.H.）、通风气流条件都有要求。譬如，NannoDropOne C操作指南规定：1）仪器置于远离通风口和排气风扇的位置以便有效减少样品水汽蒸发；2）在建议的环境湿度范围下运行时，应确保上样体积足量，确保正确的液柱形成，以免蒸发剧烈干扰测试 ^[3]。

三、微量紫外可见分光光度计测定中移液器的合理选型

       正所谓量变引起质变的道理，当样品体积的量变达到一定限度后，与测试有关的各种内外矛盾就会发生质变而对测试精准性产生制约。

       紫外可见光度检测的测试光程从标准10mm降至0.03-1.0mm后，测试样品体积骤减至2.0µL。此时，测试环境因素和内部水汽蒸发规律共同作用下，样品体积的改变就对测试结果有决定性影响力。因不同体积测试过程对水汽蒸发引起的样品浓缩作用抵抗力不同，确保上样体积的精准、稳定控制的同时，减少测试操作期间样品水汽蒸发损耗，就成为微量样品检测中技术关键问题。

3.1  移液器上样精度的控制

       NannoDropOne C微量紫外可见光度计的单个样品测试体积可低至0.5–2.0μL。移液器系统固有移液误差、手工点样操作误差的叠加，每个测试样品的实际上样体积存在差异是难免的，点样后至仪器自动测读期间样品因水汽蒸发量不同，样品的浓缩程度不一，造成样品测试稳定性、精准度下降，测试结果波动。因此，在样品体积许可情况下，一方面应尽可能增加单个样品的上样体积，降低样品水蒸发速率，减缓因液体浓缩对测试结果的干扰。另一方面，为精确移取2.0-5.0µL样品，采用与测试体积匹配的移液量程，并尽量选择高精度、高稳定性的电动或手动移液器执行移液操作。

表2  eppendorf Research Plus单道移液器移液精准度表

       从Research Plus系列单道移液器移液精准度数据看，移取2μL纯水时移液误差，0.1–2.5μL移液器与0.5–10μL移液器性能接近（约±2.0%），要远优于另两款2–20μL移液器（误差±5.0%）。这说明，0.1–2.5μL与0.5–10μL两款移液器与原厂高品质吸头组合情况下的移液精度，可以满足NanoDrop OneC、Nanodrop lite Plus、L-SP-A、L-SP-B、Unano-1000和Nano-300微量紫外可见分光光度计的测试要求。这与Nanodrop用户指南的要求一致。Research plus系列0.5 - 10µL 8道可调量程移液器移取2.0μL提及的误差低于5.0%，与NanoDrop Eight、Aurora-8000八道微量紫外可见分光光度计测定要求是匹配的。

       就现有的技术资料看，并非所有品牌移液器移液精度和误差范围达到上述微量紫外可见光度计稳定可靠测定的要求。因此，移液器的选择，是确保超微量样品紫外光度测定稳定性和测试精度的重要一环。

3.2 点样操作时间控制

       如前所述，在水面蒸发速率相对稳定条件下，相同体积的半球形液滴，测试期间的水汽蒸发总量与蒸发时间相关。点样后暴露过程和测读耗时长，水汽蒸发量大，则样品测试误差大，数据可重复性、稳定性低。

       诚如《Implen NanoPhotometer微量紫外可见光度计隆重上线》文中所言，由于NanoDrop OneC（0.03mm/0.05mm/0.1mm/0.2mm/1.0mm五挡光程）、L-SP-HB（0.02mm/0.05mm/0.2mm/1.0mm三挡光程）和Unano-1000（1nm/0.2nm/0.05mm 三挡光程)、Nano300（0.2mm/1.0mm双光程）等不同微量紫外光度计所设置的测试光程档数不一，单个样品完成全部光程扫描所需时长不同，样品测试时长不同，这意味着相同体积样品在不同机型上测试期间，水汽蒸发总量事实上存在着差异。

       此外，从实验操作而言，在完成精细移液点样后，应立即放下检测臂启动样品测读，以缩短样品在检测窗暴露时的水汽自由蒸发时间，降低测试误差。而这对于样品测读时间较长的机型具有实实在在的意义。

       有研究人员曾反映， NanoDrop One单道微量紫外光度计测定核酸样品的读数误差很大，分析主要原因是传统单道手动移液器的移液精度和稳定性差，批内样品点样体积波动过大所致。故对于实时荧光定量PCR检测中核酸模板浓度和品质评估，提出在8通道NanoDrop Eight测试平台上、并采用8通道高精度移液器执行批量点样操作，有望提高qPCR测试数据精准性和可靠性。

       因此，单通道精密移液器用于执行单通道微量紫外光度计的点样操作十分理想，但不适用于NanoDrop Eight、Aurora-8000及NanoPhotometer N120这类多通道微量紫外可见光度计采用。因为采用单道移液器逐个检测位点依次点样操作，造成检测窗上第一个与最末一个样品在点样后水汽自由蒸发时长上差异悬殊，认为加大了同批次样品测试结果的误差。可选择0.5–10µL量程可调的Xplorer plus、Research plus这类多道电动或手动移液器，一次性完成多个样品同步操作，可避免因水汽蒸发时长不同因素加大测试误差，有利于获得高精准的测试结果。

【参考文献】

[1]申德裕.介绍计算水面蒸发量的几种方法. 水利信息化，1996, (4) : 24-28

[2]毛海涛, 王正成, 王晓菊, 等. 北疆平原水库水面蒸发模型的建立与关键参数确定. 农业工程学报, 2018, 34(6): 129-136.

[3] NanoDrop微紫外/可见光分光光度计用户手册（Revision B）