低氧细胞实验中三气培养箱氮气使用有效管理问题的解决方案——中

 （前续：低氧细胞实验中三气培养箱氮气使用有效管理问题的解决方案——上） 

二、低氧细胞实验中三气培养箱的氮气消耗途径和流量需求

2.1 CO₂培养箱运行中的CO₂气体的消耗模式分析

       研究表明，健康成年女性体内细胞总数均值约28万亿个。平和呼吸状态下，以潮气量500mL、呼吸频率12次/min计算，通气量为6L/min。已知吸入气体中O₂、CO₂体积占比分别为21%、0%，呼出气体中O₂、CO₂体积占比分别为16%、4%，则每分钟实际消耗O2和实际呼出CO₂体积分别为30mL、20mL。

       据测算，诸如Heracell VIOS 160i、CellXpert C170i、CellXpert C170和CB 170等内部容积160-170L的CO₂培养箱，满载情况下可培养的细胞数量不过50亿个。若与人体近30万亿个细胞比，则培养细胞群每日所吸收O2和排放CO₂体积约均不超过10mL，可以完全忽略不计。因此，无论CO₂培养箱或低氧型三气培养箱，在连续工作状态下，CO₂气体的损耗主要经样品存取开启箱门时的快速逃逸和和培养箱通气口CO₂分子扩散引起的缓慢泄漏这两个途径造成。

       据悉，一瓶40L CO₂气气瓶（12.5Mpa充填压力，室温下体积按5000L计算）对170L容积培养箱连续供气约3个月，则CO₂气体日消耗量约55L。

       实际工作中，培养箱内工作空间利用率通常低于75%，以确保O₂、CO₂、水蒸汽的充分对流和箱内温度均一。170L CO₂培养箱内如有40%空间被带盖的各类培养容器填充，则剩余60%空间，约100L气体为气体自由流动空间，而其中CO2体积为5L。

       当箱门开启时，随着37℃混合气体外逸，其中的CO₂将快速消散。箱内CO₂浓度降低，将触发CO₂气体调控机制启动而开始向箱内输入CO₂以试图恢复CO₂浓度，这样就箱门开启状态下，箱内一边输入CO₂，新补充CO₂迅即从敞开的箱门逃逸。故箱门开启期间，实际损失CO₂体积或超过5L。而多人共享培养箱的条件下，若每日集中启闭箱门2次，则日CO₂损耗量在10L以上。箱内装载样品越少，则气体自由流动空间越大，气体逃逸更充分；开门回合越多，因样品操作而致CO₂损耗势必更甚。

       细胞培养箱的背板上设有带0.2μm孔径滤器的进气口，用于因CO₂、N2输入而致箱内气压升高时排出部分气体以平衡箱内外气压。持续运行的培养箱内CO₂气体分压5%，而箱外空气中CO₂这一数值近于0%。通气孔两侧的CO₂气体分压差，迫使箱内的CO₂气体持续地以扩散方式外泄到箱外。结合55L的CO₂日耗量和每日启闭箱门带来的10L操作损耗数据可知，经通气口扩散外溢的CO₂体积每日约45L。不同型号的培养箱，譬如MCO-50M（容积50L）、MCO-170M（161L）、Heracell VIOS 160i（165L）、CellXpert C170i（170L）、CB 170（170L）和Heracell VIOS 250i（255L）等培养箱，内部容积虽有差异，但CO₂工作浓度设定值和箱内CO₂分压差一致，而机箱的通气口均为一个。因此，所有CO₂培养箱运行时CO₂扩散泄漏的速度大致相同。只是箱体工作容积越小，经通气口CO₂泄漏体积在工作总消耗量的占比更高。

       题外话：每日经CO₂培养箱泄漏进入细胞间的CO₂气体多达数十升之多，将对室内O₂浓度产生持续稀释作用。特别是当细胞间有多台同类设备同时运行情况下，室内CO₂大量积聚不仅造成CO₂分压超更会导致O₂分压降低。故细胞培养室应具有可靠的通风换气条件，便于将每日培养箱正常运行排放的CO₂及时排出，获得新鲜空气的补充。避免因造成的空气中O₂分压下降，造成实验人员的不适反应和对细胞培养结果的干扰。详情可参考本文参考文献中制造商官方操作指南和国家相关法规内容。

       事实上，看似洁净的细胞间，不仅存在“正常的”CO₂泄漏污染，优于具有相同气体排放机制，如使用三气培养箱，还会出现N2泄漏污染。而我们基于对CO₂培养箱工作气体的排放途径及原理，可以测算170L的三气培养箱气体的损耗情况。

2.2 三气培养箱运行中气体消耗模式分析

       根据格雷姆气体扩散定律（Graham's law），在相同温度和压力下，气体的扩散速率与其摩尔质量的平方根成反比。

       三气培养工作气体中，O₂、N2的分子量小于CO₂分子量。当箱内外气体接触界面两侧各气体组分的分压差一致情况下，小分子量的O₂、N2气体分子扩散速度会比CO₂分子更快。

       三气培养箱工作条件设定为5%-O₂、5%-CO₂时，基于箱体内外O₂、CO₂、N₂三种气体在箱内外接触界面两侧的气体分压差、气体扩散定律和已知CO₂分子扩散流量，可获得如下测算结果。

表3 5% O₂含量工作条件下三气培养箱工作气体外泄扩散速度理论测算表

       170L三气培养箱内部空间利用率按40%计算，则102L自由空间全部由培养环境气体充满。

       如每日箱门需启闭2次，则每日箱内O₂尽流入量约200L，同时箱内N2尽流出量约150L。为恢复箱内O₂浓度，除应补充150L损失的N₂，还须用与流入O₂同等流量的N₂置换O₂。因此，在不考虑气体输入期间通气口少量气体泄漏损失情况下，每日须补充N₂约148+203=351L。

       根据理想气体状态方程（p1V1/T1＝p2V2/T2），40L氮气钢瓶（充装压力12.5MPa）。气体升温至37℃时，可用气体总体积约5036L。在三气培养箱连续运行过程中，40L气瓶供气续航时间约14.3天；如培养箱为多人共享每次箱门启闭超过2次，则气瓶供气持续时间进一步缩短。需指出的是：（1）这一测算结果还不包括培养箱首次启动时内部气体环境初始化过程所消耗的大量N₂；（2）测算是基于O₂浓度设定为5%这一前提进行的。如实验中O₂浓度设定为1%，则日N₂补充流量飙升至465L，40L氮气瓶持续供气时间骤降至10.8天。

       有一篇原创作者信息、数据来源不详的网文《三气培养箱耗气量到底会有多少呢？》，在众多国产三气培养箱厂商中流传甚广。文中提出：三气培养箱，CO₂和O₂浓度都设定为5%时，首次开机初始化过程N2进气量为培养箱容积的2倍，而运行过程维持低氧状态所须N2则是箱体容积的4倍。故160L三气培养箱开机N₂进气量为320L，后续维持阶段日耗N₂气640L，40L气瓶供气时间为3.75天。不过，这个测算结果是错误的，而且与人们实际使用经验不符。

       我们假设三气培养内部容积为C（capacity，单位：升，下同）。细胞培养条件设定为37℃-5%浓度CO₂-5%浓度O₂。开机系统经初始化过程完成箱内空气（0.0% CO₂：21.0% O₂：78% N2）气体置换达到设定气体环境条件，即：5% CO₂：5% O₂：89% N2。初始化过程输入的CO₂体积为x，输入N₂为y。可建立如下计算关系：

5%（c+x+y）= x  •••••••••••••••••••••••••••••• ①

89%（c+x+y）=78%.c+y  •••••••••••••••••••••••••••••• ②

       求解可到5% O₂工作条件下两种气体初初始化过程所需气体流量分别为x = 0.183c；y=2.483c。

如将公式②中89%用93%替换可得到：

93%（c+x+y）=78%.c+y  •••••••••••••••••••••••••••••• ③

       根据①、③求解可得到1% O₂工作条件下两种气体初始化过程所需气体流量分别为x = 0.55c，y=9.45c。

      测算表明：

       在仪器开机初始化进程中所消耗的CO₂、N₂体积与箱体工作容积成正比。箱体容积越大，完成气体置换所消耗气体越多。而考虑到箱体背板上通气口的正常气体外泄功能后，实际消耗的CO2、N2体积数将大于上述计算值；

       相同箱体和内部空间利用率条件下，CO₂、N₂消耗量主要由O₂工作浓度值决定。O₂浓度设定越低，则这两种气体消耗越大。其中N₂消耗增长速率远高于CO₂的增长速率。5% O₂工作条件下， N2消耗量是CO₂消耗量的13.6倍。而当O₂设定为1%时，两种气体消耗量之比升至17.2倍。这两种气体更换节奏的悬殊差异，势必给实验气体的管理增加了负担；

       5% 和1% O₂浓度工作条件下，维持系统低氧状态每日需输入的N2体积并非箱体容积的4倍，而是约2.5倍和9.45倍。

2.3 三气培养箱运行中N2维护所需开支的测算

       根据北京地区实验气体服务商提供的信息，不计氮气瓶租借费，一次40L氮气送气服务收费约450元。每日箱门只开启一个回合前提下，170L三气培养箱维持5% O₂浓度持续运行期间，每半个月的N₂购气开支为450元，而若维持1% O₂浓度运行，则每周N₂购气支出将超1000元。

       尽管实际工作中，三气培养箱常年累月连续运行的情形并不多见。但上述测算结果足以说明，当三气培养箱以1%-5%的较低O₂浓度工作时，运行所需N₂消耗量之大、耗费速度之快理应值得人们重视。

      未雨绸缪，采取必要管控措施降低N₂（和CO₂）消耗，既可大幅节省实验开支，又可化解节假日期间实验时N2供应“青黄不接”风险。（后续：低氧细胞实验中三气培养箱氮气使用有效管理问题的解决方案——下）