低氧细胞实验中三气培养箱氮气使用有效管理问题的解决方案——上

       一般认为，地表海平面空气中，氮（78.08 Vol.-%：单位体积的混合气体中该气体体积所占的百分比，习惯上称作气体百分含量或气体浓度，下同）、氧（20.95%）和二氧化碳（0.04%）这几种气体的相对含量，寰宇之内皆保持稳定。因此，当人们习惯以N₂：O₂：CO₂ = 0.78 %: 0.21% : 0.0%来描述实验工作条件并由此推而广之时，就很容易认同这样的概念：不管是在德国马克斯-普朗克研究所（Max Planck Institute, MPI）, 哈佛医学院（Harvard Medical School，HMS），还是北京协和医学院，所有在地面细胞间内开展的“常氧normoxia”细胞培养实验，CO₂培养箱内部的气体环境条件是一致的。

       而大量研究报告却表明，地表空气中这三种与细胞培养密切相关气体组分的相对含量绝非固定不变。相反，这三种气体的相对比例会随着地表海拔高度、气象要素、地表植被覆盖和所在地区工农业生产活动中气体排放条件不同而变化。其中O₂、CO₂这两种气体百分含量之波动尤其明显。资料显示，仅西藏一省之内，从东部温带森林—草原—草甸区域到西部寒带温带草原—荒漠—草甸区域，在一年之内不同季节，地表年均O₂体积百分含量可在19.91% - 20.93区间波动。我国幅员辽阔，不同地域地表空气中O₂相对含量波动幅度要超出这一区间。

       我国《缺氧危险作业安全规程GB8958-2006》规定，当特定环境的空气中O₂的百分含量低于19.5%，则该工作场所应被视作缺氧场所而而需对其间进行的各种作业加以监管。因各种原因造成细胞培养间内空气中O₂的含量低于此标准时，则细胞也会因此而从“常氧”氛围悄然落入“缺氧”的险境。

       氧气曾被认为只在新陈代谢中发挥作用，不影响基因表达。而威廉•凯林（William G. Kaelin Jr）、彼得·拉特克里夫爵士（Sir Peter J. Ratcliffe）和格雷格•塞门扎（Gregg L. Semenza）三位2019年诺贝尔生理医学奖获得者的发现表明，由红细胞生成素（Erythropoietin，EPO）、血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）、缺氧诱导因子(Hypoxia-inducible factors， HIF)组成的氧气感知通路与调节机制，使细胞能够通过调节基因表达来适应生理环境中O2含量的波动。                                              

       需氧生物细胞需要O₂供给才能通过氧化磷酸化产生ATP。O₂可利用性几乎影响所有生物学过程，包括激活多种适应性生理反应、影响能量代谢、氧化还原平衡、血管重塑等过程。因此，有效调控实验环境中的O₂含量水平，对模拟人和哺乳动物细胞的生理环境和功能活动状态具有重要意义。实际工作中，采用参考文献报道的HEK293细胞株、相同的Heracell VIOS 160i或CellXpert C170i 培养箱，以相同的工作条件并培养相同时间，有可能依然不能重现文献中的实验结果，这种情形并不罕见。究其个中缘由，除了实验设备工作性能差异因素，不同实验地点室内空气中O₂含量可能存在的差异对细胞状态的干扰，未尝不是一种合理的解释。

一、细胞培养实验对O₂控制的内在需求

       众所周知，常规CO₂培养箱标准配置中因缺少O2传感器，一般只能实时监测箱体内部的CO2气体体积百分浓度、气体温度。而细胞培养过程中O₂浓度则处于“裸奔”状态。

       科学家已习惯于用CO₂培养箱进行细胞培养，并默认箱内的O₂含量处于“天然的正常”的“常氧(normoxia)”水平（譬如某地的O₂体积百分含量为20.86%)。其实，所谓的“常氧”是一个只可意会不可言传的“暗箱”规定，并非放之四海而皆准。不同细胞培养环境下O₂含量的差异被视为可接受的实验条件误差，不仅不会被深究，而且业界还约定成俗地将其刻意忽略。但如有某君“与众不同”在公开的实验报告中将细胞培养实验条件用了“cells were cultured at 37℃, and atmosphere with 20.86% O₂ and 5% CO₂)”这样的描述，不仅会让人难以理解 “20.86% O₂”这一工作参数依据来源，甚至还会因披露此参数，让同行而对该实验数据与结论的可靠性产生疑虑。依托常规CO₂培养箱进行的细胞实验中，对氧含量问题的态度就是：你不用说，我也不会问你。

       即便没有细胞对氧气含量改变时发生自适应机制这一诺奖级研究，氧含量不同对细胞生理病理活动产生影响，在科学界也早有共识。虽然人类和动物的生命活动、组织细胞的培养实验都在“常氧”条件下进行的，但人体内部众多组织器官的微环境中的生理性氧浓度要远低于“常氧”水平，处于“生理性低氧”（physiological hypoxia）状态。

表1 人体内的生理性低氧组织列举

       目前已知，小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse Embryonic Fibroblasts, MEF)等多种原代细胞、急性髓性白血病(acute myeloid leukemia, AML) 细胞等肿瘤细胞、间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)等在较低氧浓度下培养会比在“常氧”条件下成长，能更好地模仿正常生理条件，其细胞行为也更能反映体内环境的变化。如神经元细胞在2-5%的 O₂水平下存活率、增殖和多巴胺能分化增加。人胚胎干细胞(Human Embryonic Stem Cells, hESCs)或诱导性多能干细胞（induced Pluripotent stem cell，iPSC）在低氧培养环境下，可减少细胞自发性分化、提高克隆形成率、降低自发性染色体异常频率以及增加特定克隆衍生细胞的增殖。研究人员藉由低氧培养环境控制还可模拟肿瘤内部核心细胞或称作癌症干细胞(Tumor Stem Cell)生长状况。

       文献报道中，“低氧hypoxia”的标准按O₂相对含量不同，还有生理含量氧（physioxic，5%-15% O₂ Vol.-%)、低氧（hypoxic，1% O₂ Vol.-%) 和无氧（anoxic，0% O₂ Vol.-%)的不同提法。业内则习惯于将应用环境中O₂百分比含量19%以内情形统一归入低氧范畴。

       要将细胞培养过程的O₂体积百分含量之维持在低氧水平，就须实时监测细胞CO₂培养箱内气体中的O₂浓度实际值，并使之持续稳定地维持在所设定水平。多气体二氧化碳培养箱正是在这种科学实践需求环境下应运而生。

       常规CO₂培养箱运行需要空气（其中的O₂作为细胞呼吸链中活性氧离子的来源）和CO₂（医用气体纯度≥99.0%，用作培养基缓冲体系HCO₃-组分补充来源）供应。空气中O₂含量因已达到“常氧”标准，故不作要求，无需监测。通常只配置CO₂传感器，并将CO₂浓度维持在5%的水平即可满足基础细胞培养要求。

       多气体二氧化碳培养箱，习称多气体培养箱（Multi-gas incubator），不仅要监控O₂浓度并使之维持稳定，还须在此基础上加装O₂控制单元。控O₂单元核心主要包括箱体内部的氧化锆传感器（Zirconium dioxide, ZrO₂）及O₂气控制回路、箱体外部O₂/N₂通用输入接口及连接气路。当空气中O₂浓度低于(22-90%)设定值时（高氧培养实验），向箱内输入高纯度O₂（医用氧气纯度≥99.5%）。当进行1% - 18%浓度的低氧培养实验时，需输入对哺乳动物细胞惰性无害且易于大规模制备、成本相对低廉的高纯度N₂（医用氮气纯度≥99.99%），以稀释箱内空气的O₂浓度。可见，无论是高氧还是低氧细胞培养，多气体培养箱在工作时都离不开空气、CO₂气体和N₂（低氧培养）或O₂（高氧培养）三种气源。而“三气培养箱(tri-gas incubator)”的名称正是由此而来。

表2 主流进口品牌三气培养箱的工作气体输入要求

       三气培养箱虽衍生于CO₂培养箱，但用户无法通过简单升级而实现精确控氧功能，须在设备出厂前定制。

      不仅如此，表2所列的三气培养箱型号中，除CellXpert C170i只有0.1 - 20%只有低氧控制一个配置选项外，其它品牌的同类产品，如Heracell VIOS 160i ，CB 170-230V-O和MCO-170M都提供有高、低两种氧气控制选项备选。

       从文献报道上看，生物医学实验研究中，三气培养箱多用于细胞的5%低氧模拟生理氧浓度培养和0-1% O₂的细胞缺氧（组织缺血缺氧）造模处理。 (后续：低氧细胞实验中三气培养箱氮气使用有效管理问题的解决方案——中)