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从PubMed数据看Beckman超速离心机Type 45Ti转头的配置与应用——外泌体的分离
（前续：Type 45Ti转头在蛋白分离中的应用)
二、Beckman Type 45Ti角转头在细胞外囊泡离心分离中的应用
在细胞外囊泡(EVs)离心分离应用是近10年来Type 45Ti角转头有关高分实验文献井喷的重要推手（有关技术问题可参考阿拉斯加科技发布的《外泌体超速离心分离法基础操作流程1 (译稿)》、《Optima MAX-XP台式超速离心机在外泌体分离中应用的主要类型》等文）。
Type 45Ti角转头额定最高转速45000rpm, 转头内部RCFav 158000 ×g。其RCF指标符合基础操作流程1推荐RCF要求。而转头工作容量6×94mL, 离心处理样品容量达420-550mL, 很好地适应了培养基自带外泌体颗粒排空所需的较大体积要求, 便于高效完成调节培养基的准备。
EVs差速离心分离法, EVs回收率不高, 对起始样品材料的体积有一定要求。而Type 45Ti转头单管容量大, 可同时胜任中大体积培养基样品的高速、超速离心沉两个环节的操作。
此外, Type 45Ti转头通过添加相应适配器后, 可兼容4-94mL容积范围各种常用超速离心管, 可根据实际样品体积大小和分离技术要求, 灵活选择所需的超速离心管款式与规格。
因此, 在以细胞培养基为初始样品来源的细胞外囊泡, 主要是小细胞外囊泡——外泌体的提取分离中, 深受欢迎。我们通过两个代表性实例来了解其使用方法。
实例1：巨噬细胞EVs炎症控制功能研究（Tuan Anh Phu, 2023）
巨噬细胞载脂蛋白E（apolipoprotein E, ApoE）的表达可以调节microRNA控制的NF-κB信号传导通路, 被认为在调节细胞炎症和组织修复特性中起核心作用。而研究证实, 巨噬细胞产生的细胞外囊泡(EVs)可以差异地控制受体细胞的炎症特性。ApoE的表达与EVs介导的细胞信号传导通路之间的相互关系并不清除。
通过源自对野生型小鼠骨髓的巨噬细胞（WT-BMDM）、ApoE缺陷型小鼠骨髓的巨噬细胞（EKO-BMDM）分布产生的两种细胞外囊泡WT-BMDM-EV、EKO-BMDM -EV 的对比研究显示：WT-BMDM-EV通过增加细胞 apoE 和 miR-146a-5p 水平, 从而减少 NF-κB 信号传导, 将抗炎特性传达给受体骨髓细胞。同时, 还下调了受体骨髓细胞miR-142a-3p的水平而导致CPT1A水平升高, 改善受体细胞中的脂肪酸氧化（FAO）和氧化磷酸化（OxPHOS）。实验证实, 将WT-BMDM-EV输注到高脂血症小鼠中可以解决炎症。相比之下, EKO-BMDM-EV 通过降低 apoE 和 miR-146a-5p 的细胞水平发挥相反的作用, 增加 NF-κB 驱动的 GLUT1 介导的葡萄糖摄取、有氧糖酵解和氧化应激。此外, EKO-BMDM-EV 增加了细胞 miR-142a-3p 水平, 从而降低了 CPT1A 水平并损害了受体髓系细胞中的 FAO和 OxPHOS, 传达炎症信号。高脂血症小鼠输注EKO-BMDM-EV治疗会增加造血并驱动骨髓细胞和T淋巴细胞的炎症反应。
研究结果表明, apoE表达的丧失不会改变培养的巨噬细胞分泌EVs的速率或大小, 但它会显着影响其细胞信号传导特性。巨噬细胞EVs免疫代谢调节特性具有Apo依赖性特征, 受EmiR-146a-5p和miR-142a-3p控制的转录轴。
实验中巨噬细胞分泌的外泌体的分离和纯化主要操作流程如下：
1）将BMDM以5×106个细胞/板的密度接种到15cm平板中培养6-8天后, 在自带EV耗尽的调节培养基（经Type 45 Ti转头100000×g超速离心18小时）中孵育24小时；
2）收集调节培养基, 4℃下以400×g离心10分钟以沉淀死细胞和碎片, 然后在4℃下以2000×g离心20分钟以消除碎片和较大的囊泡；
3）然后将上清液过滤（0.2μm）,添加于60%碘沙醇（iodixanol）缓冲液之下, 用Type 45 Ti转头以100000×g离心3小时, 收集沉淀；
4）重悬沉淀, 采用OptiPrep密度梯度液（5%, 10%, 20%w/v）在SW 40 Ti转头4℃下100000×g离心18小时进一步分离纯化EVs；
5）从管顶部开始收集不同密度馏分, 共获得12个1mL 级分。将梯度馏分7在PBS中用Slide-A-Lyzer Mini透析装置透析后, 用于后续细胞处理实验和EVs表征分析。
实例2：骨髓细胞EVs的CD8 + T细胞活化调节机制研究（Lisa Rausch, 2023）
急性炎症反应中循环磷脂酰丝氨酸阳性细胞外囊泡（PS+ EVs）与体内活化的CD8 + T细胞相互作用研究的动物实验中, 源自BMDC的EVs也采用了先Type 45角转头沉淀后水平转头密度梯度纯化的操作流程：
纯RPMI培养基以1：1比例与FCS混合后, 在4℃以100000×g离心18小时进行EV排空处理, 0.2μm过滤上清后-20℃储存备用；
动物股骨和胫骨骨髓细胞以1×106 / mL的密度接种在RPMI 1640培养基中培养6天后, 用30 ng/mL LPS和2 μg/mL SIINFEKL肽刺激贴壁细胞72 h后, 从BMDC收集上清液（每次实验约70个T175瓶）；
2000×g离心20分钟除去碎片；
上清用0.2μm滤膜过滤, 使用45Ti型固定角转头4℃下100000×g离心90分钟；
将含EV的沉淀重悬于含有蛋白酶抑制剂的PBS中, 并使用Amicon离心柱浓缩。
洗涤后的EVs铺垫在超透明离心管（344062）的底部；
用60%碘沙醇溶液覆盖EVs液层, 另用PBS稀释的30%碘沙醇覆盖在60%浓度碘沙醇溶液之上, 最后用PBS覆盖在离心管液体顶部, 完成不连续密度梯度溶液制备；
在SW 55 Ti水平转头中4℃下离心160000×g离心18小时；
从离心管梯度顶部收集每组馏分, 每种馏分各500μL。将馏分3至8合并后, 在Amicon离心柱中洗涤和浓缩；
纳米颗粒跟踪分析（NTA）测定EVs浓度后, 按2-7×1011 EV剂量注射受试小鼠。
上述两项研究中, EVs分离的离心参数基本与“基础操作流程1”基本一致, 不同之处有两点。
一是研究的内容, 除EVs常规表征分析外, 引入了EVs动物体内功能的验证分析。在第一轮超速离心沉淀完成后, 将第二轮洗涤EVs去除蛋白污染速的离心沉淀调整为碘沙醇密度梯度纯化, 以减少沉淀物中蛋白、其它囊泡类污染组分对体内实验的干扰。
二是第二轮外泌体纯化操作的超速样品管比“基础操作流程1”常用的0.2-1.5mL微量管大。上述实例中, 同为从培养细胞分泌的EVs, 首次超速沉淀时单管体积均为94mL, 第二轮密度梯度离心所用转头是两款工作容量不同的水平转头SW 40 Ti（6×14 mL）和SW 55 Ti（6×5.0 mL）。通常, 转头容量大, 密度梯度溶液可加载的EVs粗提物量更大, EVs最终产量大（SW 40 Ti采集的各馏分体积为1mL, 而SW 55 Ti产物体积为0.5mL）, 既方便分离后各馏分条带回收操作, 又方便体内实验中EVs接种剂量的优化调节, 操作更为灵活。
