百家秘籍
从PubMed数据看Beckman超速离心机Type 45Ti转头的配置与应用——核糖体的分离
（前续：Type 45Ti角转头在细胞外囊泡离心分离中的应用）
三、Type 45Ti转头在核糖体分离中的应用
核糖体是细胞蛋白质的合成场所, 遍布于原核、真核生物的细胞质, 真核生物细胞线粒体和植物细胞叶绿体中。生长旺盛的大肠杆菌胞体内约2.0 万个核糖体, 约占细胞总重量的1/4。真核生物细胞中的核糖体不仅数量多（为细菌内核糖体颗粒数量的50倍）, 其体积更大。核糖体体积小, 直径20-30nm, 借助于电子显微镜技术才实现可视化。其最早由美国洛克菲勒医学研究所罗马尼籍亚细胞生物学家帕拉德（G. E. Palade）发现并于1956年正式公布, 故在1958年被正式命名为核糖体（ribosome）前, 一度被称为“帕拉德离子”。
在帕拉德发现核糖体并发明蔗糖密度梯度超速离心分析技术后不久, 人们就认识到核糖体提取缓冲液中的镁离子浓度的大小不同, 得到的核糖体产物不同。镁离子浓度较高时得到的是沉降系数（sedimentation coefficient）为70S细菌完整核糖体；而镁离子浓度降低时得到是沉降系数分别为30S 和50S的两个大小不同的核糖体亚基。从发现核糖体到基本弄清核糖体蛋白质合成的精细结构基础前, 用70S指代核糖体, 以50S、30S分别命名一大一小两个亚基的做法就一直沿用至今。可见, 超速离心技术的应用在核糖体早期研究中发挥了关键作用。不同种属、不同胞内定位的核糖体, 根据沉降系数的大小, 主要分为55S核糖体、70S及80S核糖体三大类。其中, 原核和类似原核细胞的70S核糖体由50 S 大亚基和30 S 小亚基组成, 真核细胞80 S 核糖体由60 S 大亚基和40 S 小亚基组成。哺乳动物细胞线粒体内55S核糖体（mitoribosome）由28S和39S两个亚基组成。
要讨论超速离心分离核糖体, 就绕不开前人已给出的沉降系数值。
沉降系数是人们用于描述生物大分子（如核酸、蛋白）和一些大分子复合物（如核糖体、核糖体亚基）在特定液体溶液中离心沉降速度的参数。将样品分子视作外具有一定直径在超速离心力作用下的运动质点。质点在离心力和浮力作用下加速运动, 离心力减去浮力为分子颗粒所受的净离心力, 即：
F = m·ω 2·r ····················(1)
样品颗粒直径假为d（单位：cm）, 颗粒密度为σ, 颗粒自身体积为V, 溶液密度为ρ, 则质点在离心力和浮力作用下加速运动所受的净离心力F = V·(σ − ρ ) ·ω 2·r ····················(2)
颗粒以沉降速度ν在溶液中运动, 所受的流体反向摩擦阻力为f, 根据粘性流体力学的stokes 定理有：
f = 3π·d·η·ν ····················(3)
当水平方向上的净离心力与液流摩擦阻力达到平衡时, 则颗粒以匀速在溶液中沉降。此时F = f, 即：
F1 = V·(σ − ρ ) ·ω 2·r = f = 3π·d·η·ν ····················(4)
球体体积计算公式V = (4/3) •π•(d/2)³ = （π/6）•d³····················(5)
公式4和5简化可得到颗粒在溶液中沉降速度ν的计算公式：
ν = (d2/18) •［(σ - ρ)/η］•ω 2·r ····················(6)
可见, 外形规则的球形颗粒在粘度为η、密度为ρ的溶液中匀速运动速率大小与颗粒自身、密度大小、所受离心力大小有关。
而根据公式2、5和6, 可得到以下公式：
ν/F = (d2/18) •［(σ - ρ)/η］ ····················(7)
公式7中的ν/F, 即样品颗粒在单位离心力作用下的匀速沉降速度。当样品溶液条件一致时, 每单位离心力下颗粒沉降速度大小与颗粒直径、密度有关。将颗粒在单位离心力作用下移动速度视为样品离心运动属性, 定义为样品颗粒的离心沉降系数。由于颗粒直径很小, ν/F比值一般为10-13数量级。多数生物大分子的比值在10-13至10-13量级。 因沉降系数的概念由瑞典科学西奥多·斯维德伯格(Theodor Svedberg)在1924年提出。为纪念这一超速离心技术方法创立者, 沉降系数的数量单位被规定为S。1 S = 10-13（秒）。蛋白的沉降系数在1-20S之间, 核酸的沉降系数在5-100S 之间。
将沉降系数的概念应用于公式6后可知, 样品的沉降速度与沉降系数、离心力大小有关。样品溶液、转头及转速条件相同的情况下, 样品组分的沉降系数大, 则沉降速度快。
原核生物的70S核糖体由50S大亚基及30S小亚基组成。当提取液中同时含有这三种组分时, 无论是在核糖体提取缓冲液或连续蔗糖密度梯度液中, 70S核糖体的沉降速度都将大于两个亚基的速度。在提取缓冲液超速离心阶段, 首先沉淀的是70S。延长离心时间, 则依次是50S、30S亚基沉淀。因此, 利用核糖体及各组分沉淀时间上的差异, 可在同一份样品中将核糖体与其组成亚基分离。但同时须注意：离心时间过长, 样品中沉降系数为50S - 70S的（囊泡类）组分发生沉淀富集, 会带来污染。
3.1 原核生物核糖体分离
实例1. 痤疮角质杆菌70S核糖体的制备（Ivan B Lomakin, 2023）
核糖体基因序列尽管高度保守, 但不同菌种间存在广泛结构差异。开发更具病原体物种特异性核糖体靶向窄谱抗菌药物有助于避免许多靶向核糖体的抗生素大多数具有广谱抗菌活性对人体微生物组的破坏。
研究显示, 在痤疮梭菌核糖体结构中发现的核糖体蛋白bS22和bL37, 不仅确保了核糖体结构完整性, 还可以穿透细菌细胞壁并抑制蛋白质合成, 可以作为细菌素抑制革兰氏阳性表皮链球菌和病原体金黄色葡萄球菌的生长。其中的bS22只抑制革兰氏阴性大肠杆菌的生长。
第三代四环素类窄谱抗生素沙雷环素(Sarecycline, SAR)对包括痤疮梭菌在内的一些革兰氏阳性细菌具有抑菌活性。但借助于冷冻电镜研究发现, SAR可能抑制痤疮角质杆菌70S核糖体的两个活性位点。SAR除30S亚基中mRNA decoding center的经典抗菌结合位点外结合外, 50S亚基活性中心的第二SAR结合位点。SAR通过结合两个的核糖体中心/活性位点, 发挥痤疮梭菌抗菌功效和低耐药性。因此, 通过进一步优化SAR在70S核糖体的靶位, 抑制痤疮梭菌的同时, 发挥核糖体蛋白bS22和bL37的选择性抑菌功效, 维持皮肤/毛囊皮脂腺单位微生物组的稳态。
痤疮梭菌核糖体70S制备流程大致如下：
【细菌培养】
在厌氧条件下生长痤疮角质杆菌C. acnes.痤疮梭菌细胞(ATCC 11827TM)根据ATCC指南(Microbiological CμLture Media: A Complete Guide for Pharmaceutical and Healthcare Manufacturers)在血琼脂接触板上重新激活和铺板。将来自一个平板的细胞转移到装有2升脑心浸出液培养基(Brain Heart Infusion Broth，BHI)的6升烧瓶中, 并在摇床上37℃下100rpm振荡培养40小时。
【菌体裂解】
5g菌体样品悬浮在50mL缓冲液B中［20mM HEPES-KOH/pH 7.5, 200mM KCl, 20mM MgAc, 1mM DTT, 1 mg/mL溶菌酶, 1片Roche复合蛋白酶抑制剂(cOmplete Protease Inhibitor Cocktail)和100U的DNase I］；
用高压均质器中以15000 psi裂解3个周期后, 用Type 45Ti转头4℃下18000rpm离心30 min, 收集上清；
【超离纯化】
上清转移至25mL蔗糖溶液(20mM HEPES-KOH, 500mM KCl, 20mM MgCL2, 1mM DTT, 1.1M sucrose)垫层上, 用Type 45Ti转头4℃下42000rpm离心21小时, 收集沉淀；
沉淀重悬于高盐缓冲液［20mM HEPES-KOH/pH 7.5, 500mM KCl, 10mM MgAc, 1mM DTT］中, 4℃下平缓振荡孵育3小时, 重复上一步的蔗糖溶液离心操作；
沉淀用高盐缓冲液重悬, 转移至蔗糖密度梯度溶液［20mM HEPES–KOH/pH 7.5, 60mM KCl, 10mM MgCl2, 1mM DTT, 10–40% sucrose］垫层上, 用SW 32 Ti转头4℃下20000rpm离心16小时；
【浓缩保存】
收集70S核糖体对应的密度带馏分,用Amicon离心浓缩滤柱(100KDa MWCO)浓缩；
将浓缩后的70S洗脱于核糖体缓冲液［20mM HEPES–KOH/pH 7.5, 60mM KCl, 10mM MgCl2, 1mM DTT)中, 液氮保存。
实例2 金葡菌70S核糖体的制备流程（Iskander Khusainov, 2017）
【细菌培养】
在脑心浸出液培养基(Brain Heart Infusion Broth，BHI)中以37℃、180rpm振荡培养2L金葡菌RN6390, 在AD600 = 1.0 AU/mL时收获菌体；
用10mM Tris–HCl/pH 7.5缓冲液洗涤细胞两次，4750×g离心沉淀细胞(典型产量是2L培养物得到4.5–5.0g湿重菌体细胞)；
【菌体裂解】
将沉淀重悬于30mL补充有蛋白酶抑制剂混合物、DNase I和3.5mg溶葡萄球菌素的缓冲液A［20mM HEPES-KOH/pH 7.5、100mM NH4Cl、21mM Mg(OAc)2、1mM EDTA、1mM DTT］中, 37℃下裂解45min（注：裂解处理方法未载明）；
30000×g离心90min除去细胞碎片；
在上清液中添加补充PEG 20000至最终个浓度2.8%(w/v)后, 10000×g离心5min，弃沉淀；
将上清液中PEG 20000浓度增加到4.2%(w/v)后，20000×g离心10min,弃上清收集（核糖体）沉淀；
【超离纯化】
沉淀重悬于35mL缓冲液A中, 并移液至25mL蔗糖缓冲液垫层［10mM HEPES-KOH/pH 7.5, 500mM KCl, 25mM Mg(OAc)2, 1.1M sucrose, 0.5mM EDTA, 1mM DTT］上，用Type 45Ti转头4℃下158420×g下离心15小时，收集沉淀；
将沉淀重悬于缓冲液E［10mM HEPES-KOH/pH 7.5, 100mM KCl, 10mM Mg(OAc)2, 0.5mM EDTA, 1mM DTT］中。测定A260值，计算的蛋白浓度约7mg/mL。将0.5mL悬浮液移液至7–30%蔗糖密度梯度上, 用SW 28水平转头38694×g离心15.5小时；
【浓缩保存】
收集并将70S对应馏分合并后, 调节Mg(OAc)2浓度至25 mM, 加入PEG 20000至终浓度为4.5%(w/v)，20000×g离心12min将核糖体沉淀（典型的产量是来自5g细胞的10-12mg核糖体）；
将沉淀溶解在缓冲液G［10mM HEPES-KOH/pH 7.5, 50mM KCl, 10mM NH4Cl, 10mM Mg(OAc)2, 1mM DTT］中至终浓度为25-30mg/mL。分为30μL的等分经液氮速冻后-80℃储存。
实例3 大肠杆菌70S核糖体的制备流程（Liang Meng Wee, 2023）
【菌体裂解】
收集对数生长期(OD600 = 0.5)大肠杆菌MRE600(湿重约2.4g), 重悬于15mL添加cOmplete的裂解缓冲液［20mM Tris-HCl/pH 7.5, 100mM NH4Cl, 10mM MgCl2, 0.5mM EDTA和6mM β-ME)中；
用超声细胞破碎仪50mL玻璃杯在冰上裂解细胞。输出功率设置为8, 3×30秒脉冲, 30秒间隔)；
裂解液转移至50ml Nalgene Oak Ridge管中, 在Avanti JXN-26离心机JA-20转头中4℃下16000rpm离心15min；
用5mL裂解缓冲液冲洗沉淀后, 将冲洗液、上清合并后，样品总体积约27mL；
【超离纯化】
转移至35mL蔗糖溶液［20mM Tris-HCl/pH 7.5, 500mM NH4Cl, 10mM MgCl2, 0.5mM EDTA, 6mM β-ME, 37.7%(w/v) sucrose］垫层上（在Beckman 70mL带盖透明超速离心瓶中制备）, 用Type 45Ti转头4℃下33000rpm离心22小时；
弃上清, 将沉淀4℃下风干10min后, 重悬于2mL缓冲液［10mM Tris-OAc/pH 7.5, 60mM NH4Cl, 7.5mM Mg(OAc)2, 0.5mM EDTA, 6mM β-ME］中, 4℃孵育2小时；
用梯度混合器（在open-top thick wall管 355642中）生成从上至下10–40% (w/v)的蔗糖连续密度梯度溶液(共6管)；
测定悬浮溶液的A260值, 计算核糖体的浓度相当于85mg/mL；
将悬浮液再次转移至蔗糖梯度溶液层垫上, 用SW 32 Ti转头4℃下22000rpm离心17小时；
【浓缩保存】
从管底部开始, 监测A260值, 以1.5mL/min流速收集样品馏分；
收集和合并含70S核糖体馏分, 用Type 45Ti转头4℃下45000rpm离心20小时，弃上清；
将沉淀4℃风干10min后, 重悬于4℃梯度缓冲液中, 分成25μL等分, 液氮速冻后-80℃储存。
实例4 嗜热链球菌(T. thermophilus) 70S核糖体纯化和核糖体复合体重构（Alexey Rozov, 2015）
【菌体裂解】
所有操作均在4℃下进行。
用1L缓冲液A(150mM MgCl2, 500mM NH4Cl, 40mM Tris-HCl/pH 7.5, 1.5mM EDTA-Na 2, 1mM DTT)洗涤和重悬细胞(100g)；
重悬液中加入DNase(1U/mL)和PMSF(1μg/mL),用高压均质器裂解菌体；
30000×g离心30min除去菌体碎片；
【超离纯化】
上清液转移至1.5M 蔗糖缓冲液［1.5M sucrose, 0.68M CsCl, 150mM MgCl2, 20mM Tris-HCl/pH 7.5, 1.5mM EDTA-Na 2, 1mM DTT］垫层上, 用SW 28水平转头100000×g离心20小时；
收集底部的5mL馏分, 用缓冲液B［50mM MgCl2, 150mM NH4Cl, 20mM Tris-HCl/pH 7.5, 0.5mM EDTA-Na2, 1mM DTT］稀释3次, 转移至1.8M蔗糖缓冲液［1.8M sucrose, 0.8M CsCl, 150mM MgCl2, 20mM Tris-HCl/pH 7.5, 1.5mM EDTA-Na 2］垫层上, 用SW 28水平转头100000×g离心40小时；
收集底部4 mL缓冲液馏分, 在缓冲液B中析。将4M (NH4)2SO4溶液加入透析液并调整其终浓度至1 M；
将透析液（按A260测定值计算，相当于核糖体500mg)移至含1M(NH4)2SO4的缓冲液C［10mM MgCl2, 400mM NaCl, 20mM Tris-HCl/pH 7.5, 0.5mM EDTA-Na 2, 1mM DTT］预平衡的200mL Toyopearl Butyl 650S蛋白纯化柱上。用含0.8 M(NH4)2SO4的两倍柱体体积的缓冲液C洗涤后，保持缓冲液C的其他组分恒定(流速6mL/min, 馏分体积12mL), 用900mL反向梯度(80-40%)的(NH4)2SO4洗脱。将(NH4)2SO4和MgCl2浓度分别调节至1 M和50 mM，在Toyopearl Butyl 650S纯化柱中洗脱70S，检测A260值收集70S核糖体峰；
将7S核糖体洗脱液用缓冲液D［10mM Mg(OAc)2, 50mM KCl, 10mM NH4Cl, 1mM DTT, 10mM HEPES/pH 7.5］中透析后，移至用缓冲液D制备的5–20%蔗糖梯度溶液垫层上, 用SW 28水平转头15400rpm离心17小时；
【浓缩保存】
收集并合并70S核糖体峰馏分, 用Type 45Ti转头45000rpm超速离心过夜；
将沉淀重悬于稀释的缓冲液D中（5mM HEPES/pH 7.5）（分成等分在液氮中快速冷冻并-80℃储存或进行下一步操作；
将70S核糖体(3μM)与过量的mRNA、3-5含量的tRNA在37℃、pH 7.0缓冲液［10mM Tris-乙酸盐、40mM KCl、7.5mM Mg(OAc)2、0.5mM DTT］中一起孵育形成核糖体复合物。
3.2 真核生物细胞核糖体分离
实例5 酵母菌核糖体的制备（Liang Meng Wee, 2021）
【菌体裂解】
收获生长到指数期的YAS2488酵母细胞，在液氮中冷冻, 用研钵和研杵研磨破碎菌体；
菌体粉末悬浮于裂解缓冲液［20mM HEPES-KOH/pH 7.4, 100mM KOAc, pH 7.6, 2.5mM Mg(OAc)2, 1 mg/ml Heparin, 2mM DTT, 0.5mM AEBSF］中，4℃下18000×g离心10min，弃沉淀；
【超离纯化】
收集上清并转移至1.1M蔗糖缓冲缓液［20mM HEPES-KOH/pH 7.4, 100mM KOAc, pH 7.6, 2.5mM Mg(OAc)2, 500mM KCl, 2mM DTT］垫层上, 用Type 45 Ti角转头39000rpm离心5小时20min；
沉淀重悬于缓冲液［20mM HEPES-KOH, PH 7.4、50mM KCl、5mM Mg(OAc)2、0.1mM PMSF、0.1 mM benzamidine、2mM DTT］中, 转移至10- 40%蔗糖梯度溶液垫层上, 用SW 32.1 Ti水平转头32000rpm 离心5小时；
【浓缩保存】
收集80S峰并将缓冲液交换至再结合缓冲液［3mM HEPES-KOH/pH 7.4, 6.6mM Tris-HOAc/pH 7.2), 3mM NH4Cl, 6.6mM NH4OAc, 48mM KOAc, 4mM Mg(OAc)2, 2.4mM DTT］；
纯化的核糖体-80℃储存。
3.3 核糖体亚基分离
实例6 从大肠杆菌MRE600中纯化30S和50S核糖体亚基（Powers, T.，1991）
【细菌培养】
将含有100mg/L氨苄青霉素的500mL LB肉汤接种1ml饱和过夜培养物, 并在37℃下生长至A650 = 0.5。然后将培养物在冰上冷却20min, 在4℃下用Sorvall GSA角转头8000rpm离心15min；
【菌体裂解】
将细胞洗涤并重悬于15mL缓冲液［50mM Tris-HCI(pH 7.6, 10mM MgCl 2 100mM NH4Cl, 6mM β-ME, 0.5mM EDTA］中，用高压均质器18000 psi下连续两次裂解处理；
加入10μg的DNase I后, 用Sorvall SS34角转头(SS-34: 8×50 mL: Max. RCF 50228 xg/25000rpm)在4℃下15000rpm离心各15min两次；
【超离纯化】
裂解物中NH4C1调节至0.5 M, 在4℃下用Type 60 Ti角转头(8×38.5mL, Max. Speed 60000rpm)40000rp离心4小时；
将粗核糖体沉淀洗涤并重悬于1mL缓冲液［50mM Tris-HCI/pH 7.6, 6mM MgCl2, 100mM NH4CI, 6mM β-ME］中, 转移至同一缓冲液中制成的40mL 10-40%(W/V)蔗糖梯度溶液上，用SW 28水平转头4℃下20000rpm离心13小时；
测定每个管中的A260值, 收集1mL馏分, 并合并含有70S核糖体峰馏分；
【浓缩保存】
将MgCl2浓度升高至10 mM, 并用缓冲液［50mM Tris-HCl(pH 7.6, 10mM MgCl2, 100mM NH4Cl, 6mM β-ME］将体积补充到1 mL；
4℃下用Type 60 Ti角转头40000rpm离心13小时；
将沉淀洗涤并重悬于250μL的缓冲液［50mM Tris-HCl(pH 7.6, 10mM MgCl2, 100mM NH4Cl, 6mM β-ME］中（通常产生4mg核糖体）；
4℃用微量离心机中离心2min后, 将核糖体等分, 在干冰/乙醇浴中快速冷冻, 并储存在 -80℃；
【核糖体解离】
70S核糖体 通过1mM Mg2+低盐缓冲液透析对Tris-polymix缓冲液进行透析, 解离出30S和50S亚基, 后在同一缓冲液中进行蔗糖梯度超速离心。
实例7 50S、30S核糖体亚基的分离（Ivan B Lomakin, 2023）
【超离纯化】
重复70S核糖体提取流程中提取操作；
【核糖体解离】
收集经第二轮蔗糖梯度离心后沉淀, 用解离缓冲液［20mM Tris–HCl/pH 7.4, 60mM NH4Cl, 1mM MgCl2, 0.5mM EDTA, 14mM β-ME)重悬；
加样在15–40%蔗糖梯度溶液 [20mM HEPES–KOH 、60mM NH4Cl、1mM MgCl2、14mM β-ME、15–40%(w/v) sucrose]顶部, 用SW 32 Ti转头28000rpm、4℃离心16小时；
收集50S和30S亚基对应馏分；
以离心浓缩器过滤操作并重复两次。
实例8 哺乳动物细胞核糖体重构（JμLia Flis, 2018）
兔网织红细胞制备不含内源性tRNA和mRNA的冷冻电镜样品。组织培养物(HEK293T)的核糖体亚基纯化用于smFRET实验（JμLia Flis, 2018）
【细胞裂解】
将300mL经核酸酶处理的兔网织红细胞裂解物用50.2Ti转子4℃下40000rpm离心3小时；
将沉淀洗涤并重悬于缓冲液(5mM HEPES/pH 7.5, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 2mM DTT)中；
测定溶液A260值, 计算核糖体浓度约（20mg/mL)（核糖体浓度-A260测定值转换计算系数为：40S亚基为60 pmol/A260, 60S亚基为30 pmol/A260, 80S核糖体为20 pmol/A260）；
【核糖体解离】
将KCl浓度调节至0.5M, 加入新鲜制备的嘌呤霉素(Puromycin；1mg/mL), 按100mg核糖体1mg嘌呤霉素比例, 将最终核糖体浓度调节至10mg/mL并保持0.5M KCl，冰上孵育30min, 再经37℃孵育15min（解离核糖体亚基）；
缓冲液分层到以10 – 30%的线性蔗糖梯度溶液中［5mM HEPES/pH 7.5、500mM KCl、5mM MgCl 2、2mM DTT］, 4℃下18000rpm 的速度用SW 32 Ti水平转头离心18小时；
监测A260采集各密度梯度馏分；
40S和60S馏分峰混合并用缓冲液1：1稀释后，用Type 45 Ti角转头4℃下40000rpm离心18小时, 将50mM HEPES/pH 7.4, 30mM MgCl2, 2mM DTT］核糖体沉淀；
将核糖体沉淀重悬于缓冲液［20mM HEPES/pH 7.4, 50mM KCl, 2mM MgCl2, 1mM DTT］中，经液氮冷冻后-80℃储存。
3.4 Type 45 Ti角转头用于核糖体分离小结
无论原核、真核生物细胞，核糖体的分离制备过程依稀有章可循。
3.4.1 细胞裂解-差速离心-核糖体浓缩三步曲
对于培养的原核、真核细胞，在细胞群处于对数生长期（即培养液OD600测定值达到0.5-1.0 AU/mL）离心收获菌体。此时细胞分裂繁殖旺盛，胞内的核酸复制与蛋白合成处于高产期。从为数不多的报道看，视菌属和培养条件不同，核糖体分离所用的初始培养基体积0.5 - 2L，可收获到菌体湿重2-12g，最终核糖体产量4-12mg。
与细胞碎片、细胞核、线粒体、微粒体、溶酶体和叶绿体比，核糖体密度较小、沉降系数小。因此，与细胞外囊泡分离类似，通过细胞沉淀-碎片杂质沉淀-核糖体沉淀步骤，用阶梯式升高的差速离心方法是核糖体制备的基础手段。
核糖体制备的超速离心流程包括两个基本步骤：一是Type 45 Ti角转头沉淀，二是SW 32 Ti、SW 28或SW 32.1 Ti水平转头蔗糖连续密度梯度纯化。
Type 45 Ti单管容量70-94mL，满载情况下一次运行可离心400-550mL细胞裂解液，与Type 50.2 Ti（12×39 mL）处理处理效率相当而高于Type 70 Ti（8×38.5mL）处理通量。除主要承担从澄清后细胞裂解液或蔗糖溶液离心中将核糖体沉淀，制备核糖体粗提物外，还被用于替代Amicon Ultra (100 kDa NMWL)过滤器，将核糖体经蔗糖连续密度梯度纯化的馏分浓缩处理。Type 45 Ti采用40000-45000rpm(对应的RCFav 相当于124948-158137×g)的工作转速时, 与分离EVs及可溶性蛋白组分时转速相当, 但离心时间较长（以15-21小时常见）。
3.4.2 核糖体亚基分离
当溶液中Mg2+浓度≥10nM核糖体处于紧密耦合状态，而降低g2+浓度至2nM时核糖体发生解离,利用这一特点，在成功分离完整核糖体后，只需调整MgCl2浓度，即可实现在相同技术流程中选择性制备完整核糖体或核糖体组成亚基。因此，无论是提取缓冲液 或纯化用蔗糖梯度溶液，均采用10mM或更高浓度的MgCl2溶液；而30S、50S亚基分离环节中, 缓冲液中MgCl2的浓度常降低至1mM。
完整核糖体颗粒，如原核细胞的70S核糖体，比核糖体组成小亚基（如30S、50S）的沉降系数大，沉降速度快，相同离心时间内气迁移距离长。在制备核糖体亚基的环节中，核糖体解离亚基，如30S、50S聚集形成的密度条带会落后于完整核糖体的条带。同样道理，为确保实验效率，在核糖体亚基蔗糖密度梯度离心分离环节，可设定比分离完整核糖体时高的工资转速，以提高亚基分离效率、提高小亚基组分的回收率。
四、讨论
按文献报道的数量统计，在Beckman立式超速离心机在役转头中，Type 45 Ti角转头是仅次于Type 70 Ti角转头(8×38.5ml)的高频率使用角转头。
蛋白、病毒、细胞器及纳米颗粒物分离，被认为是超速离心技术的经典应用领域，在上述117例与Type 45 Ti有关的实验报道中确已有所体现。
当Type 45 Ti以最高转速45000rpm运行时，其RCFav 158000×g的输出性能，被证明是很好地适应了细胞外囊泡(EVs)、细胞核糖体及蛋白活性组分分离制备对离心力的要求。
Type 45 Ti的单管容量高达94mL，样品离心通量居所有现役超速工作转头之首。这对于从多达1-2L体积的细胞、菌体培养物中提取蛋白、EVs和核糖体，大有裨益。
在Beckman立式超速离心机中，Type 70 Ti、Type 45 Ti和Type 50.2 Ti是报道中最常使用的三个角转头。与Type 45 Ti（6×94mL；45000rpm/RCFav 158000×g；k factor 133）相比，Type 50.2 Ti（12×39mL；50000rpm/RCFav 227000×g；k factor 69）的最大工作容量基本一致，而最高工作转速、RCFav和k factor则略胜一筹。因此，就EVs、核糖体和蛋白制备而言，三者间Type 50.2 Ti的综合效能居首无疑。
在角转头工作过程中，各种细胞器、可溶性蛋白组分和囊泡在强大离心力作用下向外、向下沉降。而密度相对较低的脂质组分则在溶液中向内、向上飘浮。这一原理被应用于组织细胞中脂蛋白、游离脂肪酸、脂质体等脂质组分的分离。
上述实例中，关于脂质分离应用的报道数量微不足道。这一方面意味着Type 45Ti凭借RCFav 158000×g性能可将脂质与其它胞内活性组分完全分离的支持证据不足。同时还应看到，与Type 70 Ti（8×38.5mL，φ25×89mm；70000rpm/RCFav 361000×g，k factor 44）和Type 50.2 Ti（12×39mL，φ25×89 mm；50000rpm/RCFav 227000×g；k factor 69）比，一个显著区别在于离心管尺寸不同。Type 45 Ti（6×94mL，φ38×102 mm；45000rpm/RCFav 158000×g；k factor 133）所用的94mL超速离心管管径、管长均大于Type 70、Type 50.2所用的38.5mL管。脂质组分分离后，与PA材质管材内壁存在较大接触面，会造成脂质大量吸附，不利于完整收集。反观Type 70、Type 50.2，平均离心力大，对脂质之外其它可沉降细胞组分效能更高，且所用超速离心管的管径小，内壁脂质可吸附面积小，样品回收率更高。
资料表明，无论是蛋白、核糖体或EVs制备，多数应用报道中，除Type 45Ti角转头外，还需根据沉淀体积选用单管容量相对较小的SW 32 Ti（6×38.5mL）、SW 28（6×38.5mL）或SW 32.1 Ti（6×17mL）等水平转头20000 - 32000rpm实施1-2轮密度梯度纯化。特别是核糖体复合物重构应用实验中，在完整核糖体分离基础上，通过调整Mg 2+浓度将核糖体亚基解离后，在分离核糖体亚基过程中，尽可能去除内源性tRNA，mRNA新生肽链伴侣分子和肽链膜靶向因子等新生链复合物（RNCs），以制备出高品质的冷冻电镜分析样品。
参考文献
[1] J. Andrew N. Alexander, Liam J. Worrall, Jinhong Hu, et al. Structural basis of broad-spectrum β-lactam resistance in Staphylococcus aureus. Nature. 2023; 613(7943): 375–382.
[2] Liang Meng Wee, Alexander B. Tong, Alfredo Jose Florez Ariza, et al. A trailing ribosome speeds up RNA polymerase at the expense of transcript fidelity via force and allostery. Cell. 2023 Mar 16; 186(6): 1244–1262.e34.
[3] Ivan B Lomakin, Swapnil C Devarkar, Shivali Patel, et al. Sarecycline inhibits protein translation in Cutibacterium acnes 70S ribosome using a two-site mechanism. Nucleic Acids Res. 2023 Apr 11; 51(6): 2915–2930.
[4] Sue Im Sim, Sören von Bülow, Gerhard Hummer, et al. Structural basis of polyamine transport by human ATP13A2 (PARK9). Mol Cell. 2021 Nov 18; 81(22): 4635–4649.e8.
[5] Tuan Anh Phu, Martin Ng, Ngan K. Vu, et al. ApoE expression in macrophages communicates immunometabolic signaling that controls hyperlipidemia-driven hematopoiesis & inflammation via extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 2023 Aug; 12(8): 12345.
[6] Lisa Rausch, Lavinia Flaskamp, Ashretha Ashokkumar, et al. Phosphatidylserine-positive extracellular vesicles boost effector CD8+ T cell responses during viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023 Apr 18; 120(16): e2210047120.
[7] 刘望夷. 细菌核糖体的结构和功能. 生命科学,2009;21(6):771-780
[8] 任衍钢, 宋玉奇, 白冠军, 卫红萍.实验离心技术及生命科学中的重大发现. 生物学通报, 2013; 48(8): 60-62
[9] 任衍钢, 郭申生, 文艳萍.核糖体的发现与人知过程. 生物学通报, 2010; 45(9): 60-62
[10] 李剑勇，满亚辉，陈倩等.膜蛋白的表达：在无细胞体系中实现功能性表达、折叠和组装.生物化学与生物物理进展,2018,45(4): 389~400.
[11] Joshua A. Lees, João M. Dias, Francis Rajamohan, et al. Nat Commun. 2023; 14: 5938. An inverse agonist of orphan receptor GPR61 acts by a G protein-competitive allosteric mechanism
[12] Urnavicius L, et al. The structure of the dynactin complex and its interaction with dynein. Science. 2015;347:1441–1446.
[13] Ivan B Lomakin, Swapnil C Devarkar, Shivali Patel, et al. Sarecycline inhibits protein translation in Cutibacterium acnes 70S ribosome using a two-site mechanism. Nucleic Acids Res. 2023 Apr 11; 51(6): 2915–2930.
[14] Iskander Khusainov, Quentin Vicens, Rustam Ayupov, et al. Structures and dynamics of hibernating ribosomes from Staphylococcus aureus mediated by intermolecμLar interactions of HPF. EMBO J. 2017 JμL 14; 36(14): 2073–2087.
[15] Liang Meng Wee, Alexander B. Tong, Alfredo Jose Florez Ariza, et al. A trailing ribosome speeds up RNA polymerase at the expense of transcript fidelity via force and allostery. Cell. 2023 Mar 16; 186(6): 1244–1262.e34.
[16] Alexey Rozov, Natalia Demeshkina, Eric Westhof, et al. Structural insights into the translational infidelity mechanism. Nat Commun. 2015; 6: 7251.
[17] Fuxing Zeng, Xin Li, Melissa Pires-Alves, et al. Conserved heterodimeric GTPase Rbg1/Tma46 promotes efficient translation in eukaryotic cells. Cell Rep. 2021 Oct 26; 37(4): 109877.
[18] Julia Flis, Mikael Holm, Emily J. Rundlet, et al. tRNA Translocation by the Eukaryotic 80S Ribosome and the Impact of GTP Hydrolysis. Cell Rep. 2018 Dec 4; 25(10): 2676–2688.e7.
[19] Powers, T. & Noller, H. F. A functional pseudoknot in 16S ribosomal RNA. EMBO J. 1991 Aμg; 10(8): 2203–2214.
[20] 余兴明.实验离心技术的基本计算.
