从PubMed数据看Beckman超速离心机Type 45Ti转头的配置与应用——蛋白的分离

       Beckman Optima XPN 100/90/80、Optima XE 90/80立式超速离心机通用的Type 45 Ti钛合金材质定角转头，额定工作容量6×94mL，是除Type 19角转头（6×250mL，19000rpm）外，单管处理量最大的超速转头。其实验应用公开报道, 最早见于1978年澳大利亚费尔菲尔德传染病医院病毒研究人员从甲型肝炎患者粪便中分离甲肝病毒的实验。
       截止至2023年9月30日, 从PubMed期刊数据库中共采集到Beckman超速离心机Type 45Ti转头有关实验文献336篇。从论文发表时间看, 1978 - 2003年为转头应用的低谷徘徊期, 2004年起，实验应用及产出进入快速增长期。2004 - 2023这20年, 实验论文数量出现指数级跃升。若以5年为一统计周期，则2019 - 2023年刊文数量是前40年论文总数的1.6倍之多（见图1）。                                              

      尤其值得关注的是，2014-2023这10年总计有286篇研究报告发表。所发期刊的2023年IFoid 分值（参考https://sci.justscience.cn/查询数据）8.0分以上者达117篇。其中，包括一大批在Nature、Cell、Science、Nat Methods、Cell Discov、Nat Microbiol和Protein Cell等期刊发表的高水平论文（见表1）。

表1.  Type 45Ti转头有关部分实验应用刊文统计（2019.01-2023.09）

       这其间高水平研究论文的占比之高，不免会引起人们的好奇与思考：如许之多有重大学术价值和广泛影响力的研究项目中, 到底使用Type 45Ti转头分离何种实验对象？

       对上述117个实验报告的相关内容归类统计显示：Type 45Ti转头的应用对象主要包括蛋白质（59例）、细胞外囊泡(EVs，44例) 和核糖体（8例）。此外，微粒体和脂质等其它亚细胞组分、病毒类（慢病毒载体、甲病毒属Getah病毒）应用实例占比均低于2%(见图2)。

      为此, 我们围绕蛋白质、细胞外囊泡(EVs)和核糖体分离有关应用实例进行了考察, 以了解超速离心机Type 45Ti角转头在其中所扮演的角色。

一、Type 45Ti转头在蛋白分离纯化中的应用

      与Beckman Type 45Ti转头应用有关实例共计59例（BioRxiv平台发表文章因IFloid无法查询，不纳入统计范围）的蛋白研究存在多个维度。从蛋白在生命活动中的功能分，包括了细胞的跨膜转运、微管运输、胞内囊泡生物发生及转运、蛋白的翻译-加工修饰-折叠及定位、蛋白复合体组装及变构、RNA转录和剪辑、DNA损伤修复和DNA转座、细胞壁合成等细胞全流程生命活动。从蛋白分布定位看，有膜信号识别受体（如GPCRs）、ABC转运蛋白，阳离子选择性通道等各种膜离子转运通道、核糖体新生链复合物（RNCs）等。

      虽然不同实验所研究对象从真核生物（哺乳动物、果蝇）、原核生物（金黄色葡萄球菌、乳酸杆菌、耻垢分枝杆菌M. smegmatis等）、拟南芥、病毒（HIV-1, 噬菌体等）、螺旋体、疟原虫到DNA马达各不相同，但研究思路、方法路线相似。无论是蛋白复合体组装、配体-受体识别、蛋白与蛋白分子或蛋白-核酸结合、抗生素作用机制或细菌耐药机制等，无不基于对蛋白分子内部结构解析及与配体结合后构象改变进行的。统计显示，上述59个研究项目中的36个项目的核心方法是用冷冻电镜技术（Cryo-EM）对蛋白分子进行了3D活性构象的高分辨率分析。其余23个例是用X-ray晶体分析、电子显微镜技术、荧光偏振技术、单分子荧光共振能量转移（single-molecule fluorescence resonance energy transfer，smFRET)技术等方法完成蛋白功能效应与结构基础的分析（Structure-based mechanism）。

      蛋白组分制备技术有两种途径：一种是从猪脑、鸡肝等动物组织器官中直接提取；第二种，也是最主要的途径，是从细菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞中的一种或两种异源表达系统表达的重组蛋白进行分离纯化。异源表达体系中使用最多的是原核表达系统是E. coli BL21 (DE3)，占比44%，沙门氏菌、乳酸杆菌用的较少。真核类表达系统中，昆虫细胞表达系统10例占比17%（依次是Sf9、Hi5和Sf21），其次是哺乳动物细胞中HEK293细胞系（10.1%）、酵母表达系统（8.5%）等。

1. 代表性蛋白研究应用实例

实例1 膜蛋白（受体）的提取（Joshua A. Lees, 2023）

      药物作用靶向位点、细胞之间的信号传递，大多是通过生物膜上的特殊膜受体蛋白实现的。约50%临床药物的靶向分子为膜蛋白。生物膜上的受体蛋白的表达丰度一般较低，直接在天然生物环境中难以提取到足量蛋白。由于蛋白质翻译后还需经过修饰包括糖基化，脂肪酰化和磷酸化等修饰才能正确折叠、转运以及与胞膜整合和定位。异源表达的受体蛋白或存在错误修饰、折叠导致而不具备生物活性，或表达效率不够高效。此外，膜蛋白疏水性强，实验条件下难以维持膜蛋白正确构象，使得对膜蛋白的结构与功能的解析相对滞后。

      G 蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors，GPCRs)是真核生物中最大的膜蛋白超家族，分为A类视紫红质样受体（Rhodopsin-like receptor）、B 类分泌素受体家族（Secretin receptor family）、C类代谢型谷氨酸受体（mGlu receptor）、D 类真菌交配信息素受体（Fungal mating pheromone receptor）、E 类 cAMP环腺苷酸受体（Cyclic AMP receptor）和F类卷曲蛋白受体 (Frizzled receptor, FZD)六大类。GPCR是由7个跨膜螺旋、胞外N端、胞内C端、3个胞外环和3个胞内环的保守结构组成。胞外区域在结合激动性信号分子(如激素、神经递质、趋化因子)后，受体构象发生变化，受体胞内区域招募并与G蛋白、P-arrestin等效应蛋白、神经递质以及激素等特异性配体结合，通过环腺苷酸(cAMP)信号通路、磷脂酰肌醇信号通路和钙离子信号通路等调节体内生理活动。

      孤儿受体（orphan GPCR，oGPCR）属A类GPCR，因其内源性配体尚未发现而得名。由于配体信息和配体结合靶点不明确，且孤儿受体与结构已知GPCR同源程度较低，使得对孤儿受体的结构和生物学功能研究受阻。

      GPR61是一种与食欲相关的孤儿受体，是治疗代谢和体重障碍的药物靶标。通过构建N末端活性构象（hGPR61-dnGαs/iN18）和非活性构象（hGPR61ICL3BRIL）的重组蛋白进行人GPR61的结构表征，是对GPR61的选择性小分子反向激动剂的结合位点和受体-配体相互作用方式研究的基础。

      用于冷冻电镜研究的孤儿受体GPR61构建体表达蛋白的纯化流程大致包括以下步骤：

【异源表达系统准备】

人GPR61在活性构象中的表达构建体（hGPR61-dnGαs / iN18）和非活性构象（hGPR61ICL3BRIL）的重组构建体被转化为DH10Bac E. coli感受态细胞以产生表达质粒DNA，将其转染到Sf9昆虫细胞中以产生P0病毒。通过在无血清昆虫细胞培养基（SF-900 III）中以2×10⁶活细胞/ ml的密度和0.5的MOI感染1L的Sf-9细胞进行蛋白质表达。感染后当细胞的活力为80-85%时收获细胞。
【细胞膜制备】
收集培养的Sf-9细胞沉淀，在Dulbecco磷酸盐缓冲盐水中室温孵育30分钟，添加无EDTA的罗氏cOmplete蛋白酶抑制剂片剂后， 4℃下孵育30分钟；
将细胞用高压均质机M-110L 15kPsi裂解细胞；
将细胞裂解物在Type 45 Ti角转子中235000 ×g离心45分钟，收集沉淀；
将沉淀重悬于500mM NaCl，50mM HEPES/pH 7.5中，添加无EDTA的Roche完全蛋白酶抑制剂片剂后重复上一步超速离心操作，收集沉淀；
【蛋白分离】
将沉淀重悬于含有150mM NaCl，50mM HEPES/pH 7.5,10%甘油的低盐缓冲液中，添加无EDTA的Roche完全蛋白酶抑制剂片剂；
将粗膜提取液与1%月桂基麦芽糖新戊二醇（LMNG，Anatrace）和0.2%胆固醇半琥珀酸三盐（CHS，Anatrace）溶解在500mM NaCl和50mM HEPES/pH 7.5,100μM TCEP中，添加无EDTA的Roche完全蛋白酶抑制剂片剂，孵育90分钟；
【层析纯化】
超速离心澄清裂解液，上样值抗FLAG M2亲和凝胶层析柱，4℃下孵育2小时；
用缓冲液（500mM NaCl，50mM HEPES/pH 7.5,100μM TCEP，0.5%LMNG和0.01%CHS）洗涤FLAG树脂柱两次；
使用缓冲液（0.25 mg/ml FLAG、0.01% LMNG、0.002% CHS、150mM NaCl、50mM HEPES/pH 7.5、100μM TCEP）洗脱；
将洗脱馏分合并，在离心过滤浓缩器中浓缩；
用含有0.001%LMNG，0.0002%CHS，150mM NaCl，25mM HEPES/pH 7.5,100μM TCEP的缓冲液在Superose 6尺寸排阻层析柱(SEC)上纯化；
用SDS-PAGE分析馏分，收集合并单体GPR61对应馏分。

实例2 从猪脑中纯化动力蛋白激活蛋白(dynactin)（Sami Chaaban, 2022）

【组织准备】
采集新鲜猪大脑，置于冰冷PBS中运输；
将2个大脑（约200g）用冰冷PBS冲洗2遍，手动去除脑干和主要血管后，用HB缓冲液（35mM PIPES-KOH/pH 7.2, 1mM MgSO4, 0.2mM EGTA，0.1mM EDTA，1mM DTT）再次冲洗脑组织；
【组织裂解】
将大脑置于添加有3片无EDTA蛋白酶抑制剂片和1.3mM PMSF的230mL HB缓冲液中，用Waring均质器以均质15秒-停顿15秒的方式进行4个循环裂解组织细胞；
裂解物用JLA-16.250高速角转头16000rpm离心15min；
【蛋白分离】
上清液用Type 45 Ti转头4℃下45000rpm离心50分钟，弃沉淀；
【层析纯化】
在玻璃纤维过滤器和0.45μm过滤器中过滤上清液后，加载到250mL SP-Sepharose强阳离子交换层析柱上。柱预先经AKTA Pure SP缓冲液（35mM PIPES/pH 7.2, 5mM MgSO4, 1mM EGTA, 0.5mM EDTA, 1mM DTT, 0.1mM ATP）平衡；
用含3mM KCl的SP缓冲液洗涤色谱柱后，以3倍柱体积250mM KCl的线性梯度洗脱。收集15 mS/cm附近的峰并用0.22μm过滤器过滤；
滤液加至用MonoQ缓冲液（35mM PIPES, 5mM MgSO4, 100μM EGTA, 50μM EDTA, 1mM DTT, pH 7.2）预平衡的MonoQ 16/10强阴离子交换层析柱上。用MonoQ缓冲液洗柱后，先以1倍柱体积的150mM KCl的线性梯度洗脱，再以10倍柱体积的350mM KCl的线性梯度洗脱。将39 mS/cm附近的洗脱峰馏分合并浓缩至3 mg/mL；
洗脱液转移至用添加有5mM DTT、0.1mM ATP的GF150缓冲液洗(25mM HEPES/pH 7.2, 150mM KCl, 1mM MgCl2)预平衡的TSKgel G4000SWXL凝胶过滤柱上，将114 mL处的峰合并浓缩至3 mg/mL，分成3μL等分，用液氮速冻后-80℃储存。

实例3 金黄色葡萄球菌耐药机制研究（J. Andrew N. Alexander, 2023）

      耐甲氧西林抗生素的金黄色葡萄球菌简称金葡菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)对绝大部分β-内酰胺类(β-lactamase)抗生素具有耐药性。耐药机制由Bla基因调控系统（由编码β-内酰胺酶的结构基因BlaZ、启动子调节基因BlaR1和转录抑制因子基因BlaⅠ组成）和MecA调控系统（由青霉素结合蛋白PBP2a的结构基因MecA、上游启动子调节基因MecR1和转录抑制因子基因MecⅠ组成）介导。两套耐药基因系统同源（BlaR1和MecR1基因序列35%一致；BlaI和MecI序列61%相同）, 且转录调控模式相同。

      BlaR1和MecR1均为跨膜蛋白胞外部分为感受器结构域, 含有青霉素结合位点。细胞内为金属蛋白酶结构域, 具有裂解Blal及Mecl的功能。当β-内酰胺类抗生素等诱导剂结合到BlaR1的感受器结构域, BlaR1被激活, 其胞内锌金属蛋白酶结构域的构象改变, 水解抑制蛋白BlaⅠ水解并使之脱离BlaZ的启动子结合位点, BlaZ基因转录抑制解除, 表达产生β-内酰胺酶, 导致对β-内酰胺类抗生素出现耐药性。与此类似，MecI抑制因子通常结合在MecA基因的启动子部位。在β-内酰胺类药物的作用下, MecR1被激活, 构象改变, 诱导对MecⅠ蛋白水解并从启动子上脱落, MecA基因得以表达合成β-内酰胺类抗生素的作用靶点——合蛋白(penicillin-binding protein, PBPs) PBP2a。因PBP2a与β-内酰胺类抗生素亲和力极低, 对β-内酰胺类药物不敏感。而其所具有PBPs的完成细菌细胞壁合成功能, 却能确保在抗生素作用下细胞壁结构的完整性。

      Bla调控系统可以调控MecA基因的表达, 并且可在数分钟内诱导PBP2a的产生。而MecA调控系统从激活到PBP2a合成则需要数小时之久。因此, Bla调控系统在许多MRSA菌株广谱抗生素耐药性方面作用至关重要。

      研究还发现, BlaR1无需其他组分参与可直接自发切割BlaI（spontaneous autocleavage）启动抗生素耐药性机制。

      冷冻电镜数据表明, 耐药性BlaR1野生型与其F284A突变体（可有效结合β-内酰胺类抗生素状态）为异质二聚体穿膜结构。N端的锌指金属蛋白酶结构域在胞内, C端的可结合β-内酰胺的感受结构域位于胞外侧。两个单体间通过胞质侧的α9螺旋结构连接。胞外β-内酰胺的感受结构域与另一个单体胞外部分EL1相互作用。提示了BlaR1蛋白野生型胞外结构域与β-内酰胺类药物抗生素间还存在活性位点竞争性排斥作用。

      研究表明, BlaR1中Ser283和Phe284间存在自切割环（autocleavage loop）, 这个曲环通常占据胞内锌金属蛋白酶活性位点（F284A突变体中的自切环部位结构完整, 而野生型结构中该自切环存在未切割和切割两种状态）。自切割环卡位阻碍了锌指金属酶对BlaI、MecI转录抑制因子的水解, 而BlaI的二聚物状态可稳定结合在启动子上。当β-内酰胺结合到BlaR1胞外侧的感受结构域时, 感受结构域、胞内酶活性结构域均向细胞壁靠近和构象的变化, 使自切环脱离锌指蛋白酶活性位点。此活性位点的暴露方便了BlaI结合和水解, 耐药基因表达抑制弱化, β-内酰胺耐药基因表达的增加，产生耐药效应。

      该研究项目中，针对β-内酰胺类药物受体蛋白BlaR1的cryo-EM分析和蛋白测序应用，分别采用了两种制备流程。

1）氨苄青霉素诱导下BlaR1构象的cryo-EM分析

【菌体准备】
4℃下离心收集菌体, 并重悬于添加了5mg/mL溶菌酶和20μg/mL DNase I的裂解缓冲液（150mM NaCl, 50mM HEPES/pH 7.5）中, 37℃搅拌、孵育1小时；
裂解液冰浴冷却后，用高压均质器25000 psi下裂解菌体；
将裂解物以18600×g离心30分钟；
【细胞膜制备】
上清液用Type 45 Ti角转头4℃、40000rpm离心1小时, 弃上清收集沉淀；
【膜蛋白分离】
用Dounce均质器将膜沉淀重悬于添加1%（w/v）DDM的裂解缓冲液中，孵育1小时以提取膜；
用Type 45 Ti角转头4℃、40000rpm离心45 min后, 弃沉淀（不溶膜组分），收集上清；
上清经0.45µm滤膜过滤后, 添加咪唑至浓度20 mM/pH 7.5；
【层析纯化】
装入经平衡缓冲液处理的His-Trap HP层析柱中，分别用15mL的20mM、100mM咪唑缓冲液A各洗涤一次后, 用325 mM咪唑缓冲液A进行洗脱；
洗脱馏分用填充Sephadex G-25脱盐柱在缓冲液A中进行脱盐处理；
用离心浓缩器（100 kDa NMWL）浓缩；
【氨苄青霉素诱导变构处理】
用BioComp梯度大师配制轻重两组甘油梯度缓冲液：轻缓冲液组成包括5%（v/v）甘油, 150mM NaCl, 20mM HEPES/pH 7.5加或不加0.01% LMNG洗涤剂；重甘油梯度缓冲液组成包括 25%（v/v）甘油, 150mM NaCl, 20mM HEPES/pH 7.5；
对于氨苄青霉素处理样品, 将BlaR1（F284A）在1 mM氨苄青霉素冰上孵育约15 min, 然后用250µM氨苄西林制备所有后续缓冲液；
将150-250µL的蛋白质样品添加于甘油梯度层上, 用SW 55 Ti水平转头4℃、55000 rpm离心8小时，用BioComp梯度分馏仪收集梯度馏分；
各馏分用Amicon Ultra (100 kDa NMWL)过滤器4℃下6000×g浓缩；
浓缩后蛋白组分收集于缓冲B（150 mM NaCl, 20 mM HEPES/pH 7.5）中, 用Micro Bio-Spin P-30进行脱盐处理。

2）BlaR1自切割环位点Edmann端测序用BlaI蛋白纯化
【异源表达系统准备】
将一个BlaI-麦芽糖结合蛋白（MBP）融合结构克隆到BlaI的C端, 并具有Gly-Ser-Ser连接子。N-端用10xHis 标签设计BlaI-MBP结构, 克隆到pGEX-6P-1表达质粒中, 并转化大肠杆菌（DE3）细胞。DE细胞在LB培养基中培养至OD600约0.6 - 0.8时，用IPTG诱导细胞表达蛋白并将培养温度降低至20℃，过夜后收集菌体；
菌体在缓冲液3A（25mM Tris/pH 8.0和100mM NaCl）中裂解；
【膜蛋白分离】
细胞裂解液用Type 45 Ti转头4℃、40000rpm离心45 min；
【层析纯化】
上清用0.45µm过滤器过滤后,添加咪唑至10mM浓度, 转移至经缓冲液3A中平衡的1mL His-Trap HP亲和层析柱；
用10倍柱体积、浓度2%的缓冲液3B(50 mM Tris/pH 8.0, 500 mM imidazole, 100 mM NaCl）洗柱后, 以1ml/min流速用0-100%梯度洗脱；
洗脱组分用Amicon Ultra（30 kDa NMWL）的离心过滤器浓缩；
上样至经缓冲液3C（25mM Tris/pH 8.0,100mM NaCl）平衡处理的Superdex 75 10/300凝胶层析柱完成蛋白纯化。

2. 蛋白分离中Type 45 Ti的应用优势

       资料显示，超速离心是保持蛋白活性构象提取分离的必由之路。从操作流程上看, 无论取材于天然组织，或源于异源蛋白表达系统产生的重组蛋白，初始组织匀浆、细胞裂解液体积往往较大。对于疏水性的膜蛋白组分，往往需经历大容量低速离心收集细胞—细胞裂解液高速离心澄清—裂解上清或沉淀重悬液的超速离心分离的过程。而MBP融合蛋白、dynactin等可溶性蛋白组分，大体积裂解液直接上样到Type 45 Ti转头，只需一步操作即可将蛋白与EVs、细胞器和细胞碎片分离，获得蛋白的粗提溶液。因此，Type 45 Ti角转头超速离心功能和较大的容量，正好可以大有作为。
        不同蛋白理化属性、下游应用（如cryo-EM分析与Edmann测序分析）对样品品质要求虽有不同，但对于提取缓冲液，首先用Type 45Ti角转头超速离心沉淀处理是一致的基础步骤。与核糖体、病毒类样品分离不同，密度梯度离心环节在蛋白的提取分离中并非必须步骤。
        统计表明, 同时使用角转头沉淀、水平转头密度梯度离心两步分离的报道实例占比约1/3。先用单管容量较大的Type 45Ti角转头将可提取溶液上清中蛋白组分沉淀，再将沉淀转移至容量相对较小的水平转头进行密度梯度分级。水平转头中，最常用的是容量6×38.5mL的SW 28或SW 32 Ti, 其次是容量6×13.2mL的SW 41 Ti、SW 40 Ti 或SW 32.1 Ti (6×17mL)。用容量较小的SW 60 Ti (6×4.0mL)进行纯化也有报道。蛋白组分密度梯度离心使用较多的梯度介质是蔗糖。密度梯度离心耗时往往长达15-18小时, 对实验操作、工作效率都是一种挑战。因此，大多数报道实例中，采用的是2-3种蛋白层析柱组合的办法取代密度梯度离心实施提取液中蛋白的纯化分离。 

（后续：Type 45Ti角转头在细胞外囊泡离心分离中的应用）