联排管盖操作工具在PCR实验中应用价值浅析

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一、PCR反应密封操作不容忽视

        常规PCR实验中，PCR反应板和管内，样品体积区区10–25μL甚至更少，再多也不过50μL，因此，液体上方存在巨大空间为空气填充。缓冲液长时间都被控制在55℃以上的高温，水分子蒸发从液面逸出，在反应管液面以上空间积聚。从退火温度升温至模板双链解链温度所需的94℃-95℃温度下，蒸发作用进一步加剧，形成饱和蒸汽。当温度重新回落时，这部分水汽处于过饱和状态，部分水蒸气析出后将在温度较低的管壁上冷凝，形成水滴后回流进入底部反应液中。在PCR过程中连续进行。
        在PCR热循环过程中，水分子受热后蒸发进入管内空腔。在循环过程中，温度可达到。在这么高的温度下，水可挥发至孔内的气体空间内。该水蒸气或水流将在冷的管壁上冷凝，形成水滴后滴入底部的试剂中。在整个PCR过程中，蒸发-形成过饱和水蒸汽-冷凝挂壁或回流的水分子循环在连续进行。
        而PCR热盖温度高达105℃，热盖对密切接触的管盖具有热传导效应，会使这部分水蒸汽温度进一步升高，蒸汽压进一步增大，容易引发管盖弹开的爆管现象。此外，热盖对管盖的挤压作用，一旦压力失衡，将对PCR管盖的密封性能产生巨大挑战。
        通常，高温高压条件下管盖密封不严，PCR缓冲液蒸发水汽的泄漏，可能会造成2个方面的不良后果。

1）缓冲体系浓缩后PCR反应的异常

        PCR技术应用早期，由于PCR仪缺少防蒸发热盖，人们在PCR扩增时普遍采用在反应液面上添加一层石蜡油的方法，来减少PCR过程中，尤其是双链DNA模板94-95℃变性阶段，液体的蒸发。研究显示，石蜡油保护有增加扩增产物的作用，分析可能与其维持热恒定和缓冲液中盐浓度稳定有关。
        一般认为，反应液中金属阳离子的存在和浓度的适宜，对维持PCR产物的特异性和产量至关重要。
        在PCR缓冲液体系中，单价阳离子包括K+、Tris+等，虽然浓度都不高，但会对引物的Tm有影响。总体上，Tm随总单价阳离子浓度的升高而升高，从而抬高了引物的退火温度。K⁺浓度在50mmol/L 时能促进引物退火而有助于增产，而KCl浓度高于50mmol/L则不仅会抑制Taq酶的活性使PCR扩增效率降低，还使得原先设定的退火温度低于此时引物最适退火温度，造成非特异性扩增产物的出现。
        Mg²⁺作为PCR反应必需辅离子，在一般PCR体系中的终浓度为1.5-2.5mM，在反转录PCR中需更高浓度。实验表明，液体蒸发浓缩引发Mg²⁺过量，同样会加剧PCR非特异性扩增产物的产生；
        因此，水份蒸发造成反应体系中各组份的浓度，如模板、各种dNTP、Taq酶以及对PCR至关重要的Mg²⁺、K⁺浓度发生改变，直接影响PCR的产量和产物特异性。
        PCR缓冲液蒸发泄漏，还会极大制约10-20μL的小体积 PCR实验，同时对反应结果带来极大的不确定性。
        而实时荧光定量PCR进程中，反应孔密封不当时可出现“光学扭曲”现象，表现在扩增曲线的变形，可能引起基线问题，甚至可影响Ct值，造成检测数据的失真。

2）PCR产物外泄污染

       2021年4月22日，外媒披露，BGI在对香港4月20日采集的30个新冠检测采样检测中，因样品核酸提取制备过程操作流程不规范，发生样本交叉污染，造成最终检测结果中出现了9个假阳性病例的失误，对实验室服务声誉造成了负面影响。病毒含量相对较低测试样品溢出污染，即足以动摇实验结果的可靠性，若高浓度的PCR反应产物泄漏，造成的样品直接污染对实验的破坏和引发的实验室生物安全风险可想而知。

       同样的，对实验室PCR仪、自动化核酸提取纯化工作站等相关实验室流程设备表面沾染的质粒、基因组和扩增DNA和RNA污染的防范和控制，有助于消除PCR过程中的假阳性结果出现。

       业内人士指出，PCR反应体系温度反复升降，液体蒸发冷凝，PCR管内很容易形成携带有大量DNA扩增片段的气溶胶。反应结束后打开PCR管盖的动作过猛，或扩增过程中管盖受压变形破裂时漏液，极易造成气溶胶泄露、扩散而污染实验环境，引发生物安全风险。

       因此，无论是防生物污染的生物安全实验室，还是普通生物医学教学科研实验环境，在开始运行PCR之前，必须确保PCR管和PCR反应板进行完全密封，以防实验中发生样品的泄漏。

二、理性看待PCR仪热盖防蒸发的作用

       防蒸发热盖，即PCR仪热盖、Heated cover，是指PCR运行时压在PCR反应孔密封盖上可控制温度的金属导热装置。PCR实验启动后，热盖温度升至设定值（以105℃居多）后，系统启动PCR热循环过程，热盖的良好导热效应，使样品管盖的温度始终高于反应孔内部温度（通常不高于95℃）。因此，PCR缓冲液中受热逸出的水分只能以饱和水蒸汽形态存在而无法在管盖内表面凝结聚集。随着热循环中样品模块温度的变化，逃逸水分子在饱和水蒸汽-反应液之间不断游走、循环转换，使得PCR反应体积基本保持稳定，不会因为冷凝挂壁而减少。

       目前，热盖在PCR仪主机结构中已普遍应用。只是不同品牌和机型，热盖温度控制范围略有区别。

       譬如，赛默飞MiniAmp Plus、SimpliAmp、VeritiPro、ProFlex PCR仪，热盖温度只能在30℃ - 110℃范围内设定。

       热盖与反应管密切接触，热盖-管盖的热量会沿着管壁向下传导。如热盖设定的温度过高，可能会造成反应样品的温度高于程序设定目标温度，干扰实验结果。

       资料显示，赛默飞PCR仪系统出厂默认的热盖温度值为105℃。伯乐C1000 Touch PCR仪的热盖温度则视反应模块的样品体积不同，采用不同热盖温度（lid temperature）：96孔快速反应模块（96-Well Fast Reaction Module）或双48孔反应块（Dual 48-Well Fast Reaction Module），系统默认热盖温度为105℃；而384孔反应块（384-Well Reaction Module），系统默认温度为95℃。

       热盖的作用是防止水汽在管盖上冷凝聚集，但反应孔液面以上封闭空间仍充满高温饱和水汽，这部分逸出的水分子始终无法参与PCR反应。但如没有热盖也不加石蜡油保护，PCR缓冲体系损失的水份体积之大，足以使各反应组份浓度、反应条件发生剧变。

       需指出，PCR仪热盖在工作中竖直向密封盖施加压力并升高管盖的温度，只有对于密封管管盖安装到位处于严格密封情况下，PCR实验防蒸发才能落到实处。

       不能简单地认为，单纯依靠PCR仪热盖加持，PCR体系蒸发的风险就高枕无忧。实际操作中，由于缺少上样支架保护、密封管盖安装位置参差不齐等，反应结束后PCR管变形、管盖变形和爆管等现象屡见不鲜。

       因此，再优良的热盖压力调节设计功能，也无法替代手工和使用必要PCR密封工具对PCR样品的精细密封及采用必要PCR反应管支架，如96孔托盘-固定器组合支架（MicroAmp 96-Well Tray/Retainer Set），PCR管支架（Tube Support  Ring）等保护措施。

三、说说PCR管盖密封神器

       通常，PCR单管、八联排管可采用联排管盖密封，而PCR板则有粘性封板膜、PCR八联排管盖密封两种选项。

       我们先看一款PCR管、八联排管和PCR板通用的联排管盖密封操作工具——多功能联排管盖手柄（MicroAmp Cap Installing Tool）。

       该盖管手柄长边各有1个工作面，一面较平整，适用于平盖；另一面分布有8个凹形杯（Recessed cup），专为圆顶盖设计。对于圆凸形管盖，使用时使将盖管手柄凹形杯与凸盖对齐，下压管盖即可轻松把管盖压入反应孔中。

       之所以称其为多功能手柄，是因为工具的两个短边也设置带钉突、类似于推土机铲的工作面。将小铲上钉突插到八联盖管之间，即可将八联盖从反应板、八联排管上撬开，实现轻松开盖，便于收集利用和检测PCR反应产物。

       赛默飞还提供了一块PCR圆顶盖上盖工具(Cap-It Tool for domed cap strips)，从名字就可看出，这是专门针对圆凸形管盖压盖用的手柄。

       伯乐为方便T100、S1000和C1000 touch PCR仪样品密封和开盖，也提供了2款小工具：PCR排管盖管器（Strip Cap Tool）与PCR单管管盖工具（Easy Cap Tool）。Strip Cap Tool只有2个工作面，分别用于平顶8联排盖和圆顶联排盖的批量压盖。而Easy Cap Tool为笔式，一次只能操作一个管盖，圆顶、平顶盖通用。它还带有一个鳄鱼嘴，可以卡住管盖的边缘，手部轻轻上抬即可轻松开启管盖。

参考文献：

MiniAmp and MiniAmp Plus Thermal Cycler User Guide, Revision A.0

SimpliAmp Thermal Cycler User Guide, Revision C.0

ProFlex PCR System User Guide, Revision B.0

VeritiPro Thermal Cycler User Guide, Revision B.0

C1000 Touch Thermal Cycler Instruction Manual, Rev B

实时荧光定量PCR手册