拨开云雾见月明——英捷iBright FL1500 Western荧光成像分析仪技术特点解析-3

Western成像的iBright FL1500 Universal Mode方案

       Western Blot实验流程中，SDS-PAGE凝胶和免染胶、凝胶与Blot、ECL Blot与荧光Blot之间检测成像原理和方法不尽相同。

       凝胶无论用丽春红S、考马斯亮蓝染色，通常要用紫外-白光转换屏（叠放于紫外透射台上组合使用，将紫外线转换为白光）或LED白光板（自带电源接口，发光效率高、照明均匀，对低丰度条带分辨灵敏度高），白光从凝胶底部透射进行成像。凝胶覆盖区透射白光会因凝胶和样品吸收和散射作用，亮度减弱。但在凝胶覆盖区外，白光直射进入成像单元。若曝光时间较长，极易因CCD像元电子阱容量饱和而发生光电子外溢、污染图像成像区，使图像失去定量分析价值。不仅透射光如此，采用反射白光检测应用中，若样品反射白光过强，同样会出现图像局部过度曝光现象。为此，iBright FL1500预装有针对400-700 nm波长可见光的中性密度滤光片(Neutral density filter, ND filter)，以降低LED反射光强度，避免反射光成像过曝风险。

       蛋白印迹ECL检测须排除一切外来光源干扰。这使得蛋白凝胶、蛋白Blot成像的操作互不兼容，无法同时进行。因此，以印迹微弱光信号检测为首务的Western成像系统，白光屏或白光板均非必备附件。可喜的是，iBright FL1500的标配附件含有LED白光板！

除去亮考、银染这类非特异性染色法，用SYPRO Ruby蛋白凝胶染色剂、No-Stain免染蛋白荧光标记试剂处理凝胶的成像分析，也是样品总蛋白定量的常用手段。

       SYPRO Ruby荧光成像，既可用伯乐ChemiDoc MP、ChemiScope 6200这类标配302nm紫外透射光源的Western 成像仪进行，也可以依托iBright FL1500、iBright CL750和iBright CL1500（包括iBright CL1000）配备的488nm LED透射光源完成。为防止白光干扰荧光信号采集，凝胶样品的荧光检测和凝胶透射、反射白光分析也不可同时实施。                                              

       正是Western Blot实验流程中凝胶和印迹样品，透射与反射光运用、荧光与发光等不同检测方法之间的相互冲突，催生了多功能智能化Western成像系统。

1、iBright FL1000代表的Western多模式成像解决方案

       iBright FL1000是invitrogen iBright FL1500的上一代产品，2017年上市。

       为解决Western Blot多步骤、多种标记成像需求，iBright FL1000系统开发了4种成像模式。

表1.  iBright FL1000系统四种成像模式

       新手上机，只需根据测试样品选择一种成像模式，并确定白光板的取舍、完成样品的摆放，余下的操作，从照明的开启，激发和检测滤光片的配置实用、样品的自动聚焦、曝光时间的掌控，全部由系统智能管理。

       如选择［Fluorescent blot］进行单色或多色荧光成像，只需几步简单操作：

       1）点击染料通道dye channel键，调出可选染料列表；

表2 iBright FL1000系统荧光检测通道

       2）从列表中选择二抗的标记染料对应的检测通道(EX3和EX4为二选一)；

       3）为染料选一种色彩(系统将把不同染料标记的条带以伪彩色效果显示和区分)、设定曝光时间；

       4）确认完成一个荧光检测通道的成像条件设置；

       5）重复上述4步操作，直至完成其余荧光通道的设置；

       6）点击［Capture］启动图像的采集协议。

       讨论iBright FL1000系统的［Fluorescent blot］成像模式，是因为这个模块具有其它三种应用模式所不具备的一个图像处理功能——多通道图像叠加功能。

       在荧光Blot成像模式下，系统首先通过不同颜色检测通道分别采集相应波长荧光的图像，所有图像采集完成后，以2UP（Universal Mode Preview, UP）图像预览界面显示全部图像：预览区上部显示所有检测通道获取的黑白图像，预览区下部是将同一块Blot上在不同荧光通道独立采集、分别添加了选定的伪彩色后的由多个通道图像叠加产生的渲染图，便于研究者直观检视、对比各靶蛋白条带的信号。

       荧光Blot模式下多通道图像叠加功能，在ECL印迹检测中不适用。但Western实验结果发表、汇报时，提供Marker、TPN方法验证的图片证据，无疑使数据和分析结果更详实可信。譬如，将蛋白分子Marker序列图像、ECL检测法或多色荧光标记检测的靶蛋白条带图像和（或）连同荧光方法总蛋白检测图像合并叠加到同一张图片上。因此，iBright FL1000虽满足了Western Blot实验多个环节、多方法成像功能的需求，但无法将同一Blot不同成像模式下获取的图像整合，没有解决蛋白Blot样品分析过程重要图像信息的碎片化问题。

       因此，iBright FL1000成像系统尽管实现了多种应用模式智能化控制，使用中还依然存在不便。首先，相较于常规蛋白凝胶染色图像，大量发表的蛋白Blot图像中，只见靶蛋白条带缺少分子量Marker序列条带验证信息。其次，部分实验人员反映，采集的蛋白Blot图像中，分子量Marker条带与靶蛋白颜色深浅相反、不一致。这些Western成像和分析中的经典烦恼，随着iBright FL1500系统Universal Mode的应用而得到了完美解决。 

2、Universal Mode的Western成像解决方案

       iBright FL1500的Universal Mode（通用模式），官方定义为：

       Custom Mode to image samples containing one or more signal types, such as chemiluminescence, fluorescence, colorimetric stains, and/or visible images; image display is similar to fluorescent blot mode and allows one to assign false color to any sample.

       就是说，这种自定义成像模式，能对包含有一种或多种信号类型（化学、荧光和/或可见光）的同一个样品别按设定的成像模式、光学通道和工作先后顺序完成多中模式图像的采集，并自动将这些各自独立的图像叠加成一张图，再加上漂亮的伪彩色渲染后呈现。而所有原始图像和叠加图像均可保存和输出。

       通用成像模式适用于iBright FL1500与iBright CL1500，但iBright CL750除外。

       讨论iBright FL1500通用成像模式前，首先明确2个基本概念。

       第一，无论蛋白凝胶考染、蛋白Blot丽春红S染色，CCD曝光所采集的光学信号均非样品本身发射，是入射白光接触样品时被吸收、散射或反射后的结果。从条带区始发进入CCD的信号要弱于从条带毗邻区背景始发的信号，使CCD输出的是黑带白底图像。而蛋白凝胶或印迹，无论ECL或荧光标记、检测光源是透射抑或反射，CCD成像信号都源于样品自身发射，样品丰度越高，发光基团量子效率越高，则CCD输出的亮带暗底图像上条带越发明亮。

       第二，Western成像系统采集的图像，与经实验人员处理后用于发文汇报所用图像，本质等效而条带-背景黑白对比呈现效果相反（具体原因，参考《光密度值和灰度值如何在Western Blot条带定量和凝胶图像分析中应用? 》）。不管marker、总蛋白、靶蛋白和管家蛋白条带的成像机制如何，习惯上最终都要人为地“归一化”转为黑条带白背景的发表图片效果。

       iBright FL1500通用成像模式将荧光、发光、反射/透射白光这些互不兼容的检测程序融为一体，达到井水不犯河水般和谐，靠的是对应用的时序管理。本质是让实验人员综合权衡靶蛋白检测方法、分子量Marker类型和条带信号强度归一化方法后，依托系统个智能化检测通道成像控制功能，把对系统资源利用存在冲突的成像任务按信号检测的紧迫程度进行排队后，由成像系统动执行实验协议。通用成像模式DIY编程模块，实现了蛋白Blot成像过程一键完成。

       我们以Western实验检测AKT信号转导通路中磷酸化p-AKT水平检测为例，了解一下通用成像模式的操作流程。实验中以IGF-1诱导肿瘤细胞的AKT磷酸化，采用化学发光检测 (SuperSignal West Femto)。No-Stain 蛋白标记试剂标记所有条带总蛋白（用于执行TPN处理）。分子量Marker用的是iBright prestained marker (化学发光检测)。完成二抗孵育后在iBright FL1500上采用通用成像模式检测。

检测协议的主要设定步骤包括：

       ① 选通用成像模式

       ② 选Chemi blots通道下SuperSignal West Femto底物（化学发光法完成(AKT、marker检测）

       ③ 选择TPN No-Stain通道下的No-Stain Labeled Membrane应用（荧光通道完成总蛋白检测）

       ④ 确定点击图像捕获按钮

       在通用成像模式下，系统将按设定的顺序分阶段完成所有检测通道的图像采集。

       在2UP图像预览界面，系统将不同检测通道下获取的带marker的AKT化学发光原图、总蛋白荧光原和两个检测通道图像叠加后的图像分别显示。

3、小结

       通常，在核酸、蛋白凝胶图像中，分子量Marker序列条带是座上客（占据左侧第一泳道位置），用于指示目标条带的分子量范围。Western Blot实验按理也应遵守同样的报告规则，但实际执行情况并非如此，主要是两方面的原因造成的。
       商品化的蛋白分子Marker，无论是用户自染型、出厂预染型、Stain-free免染型、荧光标记型，还是化学发光标记型，marker都具有清晰的条带外形、适宜的条带亮度和稳定的批次重复性。即便Marker与条带都用ECL发光标记、在同一Blot上同步添加底物和上机检测，目标蛋白条带，特别是低表达靶蛋白，也难以企及marker捷足先登的优秀表现。当Marker和高表达蛋白条带信号进入系统的线性检测范围，甚至要过曝超出系统线性范围极限了，都不见弱信号条带现身。因此，实验中常进行裁膜，将靶蛋白泳道与marker条带分开，单独孵育和上机检测。不同Blot膜条转移效率存在误差、上样时摆放位置和对齐角度的偏差、系统自动曝光控制下曝光时间的差异等，使同一Blot实验生成最终报告图片，不是一张完整的mini膜，而是若干独立小裁条的拼图，蛋白条带信号强弱、条带位置和形状及图像背景表现各异。而常规成像控制软件的图片合并功能模块又难以有效适应蛋白Blot图像整合的要求。这就造成了Western 蛋白印迹报告图中的种种“合理”现状。
       Invitrogen为iBright成像分析仪开发的Universal Mode通用成像控制模式，通过软件对不同检测光学通道成像的时序管理、成像区域的设置，可对同一个转印膜进行多轮次、多方法、多目标和多图片采集（可以分批次上样和成像），并能对控制协议下全部Western Blot实验要素的图像提供整合、叠加显示功能，为研究人员带来美轮美奂、绚丽多彩的WB梦幻之图。
       通用成像控制模式实现对蛋白印迹各要素、荧光、发光、可见光成像等多种检测方法在同一块Blot上的全覆盖、大融合，又具有各独立成像控制模式的图像分析功能。Universal Mode只适用于iBright FL1500、iBright CL1500两个型号。

参考文献：

［1］iBright CL1500 Imaging System and the iBright FL1500 Imaging System USER GUIDE Rev B.0

［2］ImageJ User Guide (IJ 1.46r)