拨开云雾见月明——英捷iBright FL1500 Western荧光成像分析仪技术特点解析-2

一、Western Blot条带定量分析引入TPN方法的必要性

      Western Blot实验操作的多个步骤都可能存在误差，如样品稀释浓度和上样移液体积误差，蛋白转膜效率差异等。为使蛋白印迹条带间的信号强度差异，能准确反映出样品间的蛋白质表达水平差异，需要对Blot各泳道中条带的有效信号强度值进行归一化（Normalization）处理。归一化处理通常是三步进行。首先，对每个泳道所有蛋白条带做扣除背景操作获得各条带的有效信号强度值。第二步，从印迹上选择一个参考泳道（通常是第一个样品泳道，也可以是人为认定的其他泳道)，以参考通道的内参蛋白信号强度为基准，将其与其他泳道的内参有效信号值相除，得出每个泳道的归一化因子（normalization factor）。最后，将靶蛋白条带有效信号值乘以归一化因子，得到条带信号强度的归一化数值，以此归一化值作为蛋白表达丰度统计分析的依据。

      Western Blot实验常用内参蛋白有两种。一种是存在于所有样品中、且其表达较稳定的管家蛋白（Housekeeping protein, HKP）。另一种是印迹中各泳道的总蛋白。无论选谁做内参，都需满足两个条件：

      1）内参的表达须不受组织来源、实验处理方法的影响；

      2）电转印完成后，靶蛋白、内参蛋白的信号强度均应处于各自的检测线性动态范围内（即检测信号强度随蛋白质上样量增加而成比例增加）。

      不少研究已观察到：管家蛋白在不同组织来源表达量不同，经不同实验干预处理后表达也不相同。内参蛋白通常表达量较高，但上样量—条带信号强度线性关系表现不佳。而通常靶蛋白的表达较低，当加大靶蛋白上样量时，高表达的管家蛋白易出现过载，信号强度超出其定量线性范围的情形。因此，未经验证地将β-肌动蛋白（β-actin）、甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、α-微管蛋白(α-tubulin)和次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1 (HPRT1)等管家蛋白用作Western Blot内参，从流程到方法都是错误的。                                              

      而总蛋白归一化(Total Protein Normalization, TPN)方法则克服了管家蛋白归一化方法的诸多缺点。

      TPN是指Blot的单个泳道内所有蛋白条带的总信号值扣除背景后的总有效值确定为该泳道内蛋白总上样量、将此信号值与参考泳道相应指标来相除结果作为该泳道所有蛋白条带信号强度的归一化因子的方法。

      所有条带总蛋白作为内参蛋白，不易受实验处理方法、组织细胞来源的影响，而最重要的是，大多数总蛋白的线性动态范围能与低表达靶蛋白的线性范围匹配。研究表明，在 10–50μg常规上样量范围，总蛋白Blot信号值均表现出良好线性特征，不易出现信号过饱现象，可真实地反映该泳道的总蛋白上样量。因此，TPN方法可用于大多数蛋白Blot条带的定量分析。

      目前，部分学术期刊要求严格遵守使用内参的标准，使用可产生线性动态范围的成像技术。而越来越多的研究者在发文中Western实验中使用了TPN方法。

二、iBright FL1500 Western荧光成像分析仪适用的TPN技术方案

      电转印结束后，首先要确认全部蛋白质被正确转移到膜上，以便及时发现印迹中任何空泡和转印不均等异常情形，改进存在的问题电泳和电转实验步骤重新实验。而对Blot各泳道蛋白条带的可视化处理，既是Blot验证的需要，同时也是在为进行TPN处理做成像准备。

      验证蛋白Blot的一种常见做法是印迹的丽春红S (Ponceau S)染色（染色的Blot经冲洗后可继续执行印迹免疫检测）。染色过程耗时约20分钟不算长，但丽春红S与蛋白质结合持续时间短，须迅速完成图像采集，否则染色条带逐渐褪色后条带信号强度降低，使总蛋白的定量失准。操作时间限制，这仅是丽春红S染色法的技术缺陷而已。

      在我们看来，丽春红S染色法用于蛋白Blot条带总蛋白定量，方法的选择上就不妥。它本不应该被如此高调、理所当然地用于蛋白Blot的定量分析（注：SDS-PAGE凝胶定量例外）。

      PubMed收录期刊发文中，采用NIH ImageJ Software（也叫Fiji）进行Western Blot图像分析的文章数以万计。ImageJ使用指南中关于朗珀-比尔定律在图像定量分析应用的说明，想必知悉详情的研究人员不在少数。对于蛋白Blot条带这类样品图像信号值与样品测试成份含量关联问题，指南指出，不透明样品用反射光源照明生成的图像，因样品表面对光源散射、反射，使得这部分来自光源的信号连同图像有效信号一同被采集形成分析图像，其图像信号强度并不能代表待测样品有效含量。因此，对于蛋白Blot用反射白光照射生成的染色图像来定量总蛋白，不符合朗珀-比尔定律，定量结果准确性就更值得商榷。

      根据ImageJ指南说明，蛋白Blot这类样品检测，应该是基于样品本身发射的荧光、化学发光（生物发光）信号形成的图像进行定量分析。故采用ECL发光、荧光染料标记所获取的蛋白Blot图像作为蛋白定量依据，可谓是恰得其所。

       可用于蛋白Blot荧光标记染料，如SYPRO Ruby（SYPRO宝石红）等，不仅相对昂贵，还需固定、隔夜染色和脱色一系列精细操作处理，其过程耗时而繁琐。

      反观伯乐Stain-Free免染凝胶、Invitrogen No-Stain 免染型蛋白染色试剂代表的新型免染成像技术，不仅与下游免疫印迹检测流程完全兼容，可在短短2分钟内完成蛋白质转印效率的验证，而且条带荧光信号强度不受染色或脱色操作时间影响，信号稳定。这极大加快、简化Western Blot条带可视化和总蛋白定量过程。

      那iBright FL1500系统是否支持所有免染蛋白荧光成像技术方法？回答是：不全部支持。

       伯乐Stain-Free免染胶蛋白荧光成像技术的核心是在手灌SDS-PAGE凝胶或商品化预制胶中添加了一种三卤化合物。该化合物与蛋白质分子中的色氨酸残基共价结合，不干扰电泳或转膜实验。三卤化合物自身不产生荧光，而它与蛋白质共价复合物经302nm紫外激发能产生荧光，且荧光信号持续贯穿于凝胶电泳及转膜全过程，便于成像分析。

      而iBright FL1500配置缺少必要的反射式UV激发光（标配LED绿色透射光激发光源不适用），无法激发伯乐的Stain-Free免染凝胶完成TPN分析，故只能使用Invitrogen No-Stain免染蛋白染色试剂。

      Invitrogen No-Stain蛋白标记试剂与蛋白分子的赖氨酸侧链部分形成共价键，可在每孔上样 1–80μg总蛋白的上样量范围内保持优良的检测线性。该试剂可使用UV、绿色LED（Ex 520 mm）或蓝色LED（Ex 488 mm）光源激发，发射波长为590 nm。

      iBright FL1500同时配置有LED绿色透射光源（用于透明SDS-PAGE凝胶的激发）、反射式蓝（Epi-LED 455-485nm）、绿（Epi-LED 515-545nm）激发光（蛋白转印膜的染料激发）和波长范围568-617nm的荧光发射滤光片，可完美胜任蛋白凝胶、蛋白印迹的Invitrogen No-Stain蛋白免染荧光标记成像和对蛋白Blot的TPN检测。

三、Western Blot TPN方法应用的iBright FL1500荧光检测通道方案

      基于《英捷iBright FL1500 Western荧光成像分析仪技术特点解析-1》的讨论意见，iBright FL1500的Em3、Em4两个检测通道只能二选一。而Western Blot实验引入Invitrogen No-Stain荧光染料进行TPN校正后，为确保各靶蛋白条带、泳道上总蛋白荧光信号的特异性，TPN需单独占用EM2发射信号通道。

iBright FL1500印迹荧光成像分析仪荧光检测通道配置

      iBright FL1500可供分配给各蛋白条带荧光信号检测的通道只有EM 1、EM 3（或Em 4）、Em 5三个。这正是iBright FL1500系统配置5个荧光通道，但引入TPN方法后最多只能同时测3个靶蛋白的原因。
       其中，EM 1绿色荧光通道在检测基质复杂样品Blot时，很可能还会受到背景荧光的干扰。为改善检测信噪比，选择靶蛋白荧光二抗时，可参考以下经验做法：低丰度靶标，尽量用亮度较亮的短波长荧光基团标记二抗（如Alexa Fluor 546和Alexa Fluor Plus 647）；而高丰度靶标，则选用波长较长荧光基团标记抗体（如Alexa Fluor Plus 680和Alexa Fluor Plus 800）。
       至于如何在Western Blot实验中获取免染荧光标记Blot总蛋白图像，且听《英捷iBright FL1500 Western荧光成像分析仪技术特点解析-3》为您分解。

参考文献：

［1］Angela Dittmer, Jürgen Dittmer. β-Actin is not a reliable loading control in Western blot analysis. Electrophoresis. 2006; 27(14):2844–2845.

［2］Robert D Barber, Dan W Harmer, Robert A Coleman, et al. GAPDH as a housekeeping gene: Analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiol Genomics. 2005;21(3):389-95.

［3］Rena Li, Yong Shen. An old method facing a new challenge: Re-visiting housekeeping proteins as internal reference control for neuroscience research. Life Sci.2013;92(13):747-51.

［4］Xiaowen Hu, Shujiao Du, Jiekai Yu, et al. Common housekeeping proteins are upregulated in colorectal adenocarcinoma and hepatocellular carcinoma, making the total protein a better "housekeeper". Oncotarget. 2016;7(41):66679-66688.

［5］Samantha L Eaton, Sarah L Roche, Maica Llavero Hurtado, et al. Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting. PLoS One. 2013;8(8):e72457.

［6］Roisean E Ferguson, Helen P Carroll, Adrian Harris, et al. Housekeeping proteins: A preliminary studyillustrating some limitations as useful references in protein expressionstudies, Proteomics. 2005;5(2):566-71.

［7］J J Bass, D J Wilkinson, D Rankin, et al. An overview of technical considerations forWestern blotting applications to physiological research. Scand J Med Sci Sports.2017Jan;27(1):4-25.

［8］Rajeshwary Ghosh, Jennifer E Gilda, Aldrin V Gomes. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Rev Proteomics. 2014 Oct;11(5):549-60.

［9］Samantha Greer, Rice Honeywell, Mulu Geletu, et al. Housekeeping genes; expression levels may change with density of cultured cells. J. Immunol. Methods.2010;355(1-2):76–79.

［10］Georgina M Aldridge, David M Podrebarac, William T Greenough, et al. The use of total protein stains as loading controls: an alternative to high-abundance single-protein controls in semi-quantitative immunoblotting. J Neurosci Methods. 2008;172(2):250-4.

［11］J J Bass, D J Wilkinson, D Rankin, et al.An overview of technical considerations for Western blotting applications to physiological research. Scand J Med Sci Sports. 2017;27(1):4-25.