赤橙黄绿青蓝紫 谁持彩练当空舞——激酶活性HTRF检测的荧光酶标仪方案-上

基于应用的多功能荧光酶标仪选型-3

       均相时间分辨荧光技术(Homogeneous Time-Resolved Fluorescence，HTRF) 是法国Cisbio公司（2019年并入美国PE）融合荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）和时间分辨荧光（Time-Resolved Fluorescence, TRF）两种技术基础上创建的一种TR-FRET分析方法。最早的报导见于G Mathis在1993年9月Clin Chem (IF 12.1670)的《Rare earth cryptates and homogeneous fluoroimmunoassays with human sera》一文。

       HTRF、FRET及TR-FRET分析技术，研究的都是纳米尺度空间内两种或多种生物分子间的特异性相互结合、相互作用的关系。但HTRF技术在测试稳定性、灵敏度、简便性和高通量兼容性上，具有特殊优势。在制药企业、科研院所药物研究中心的新药研发中，HTRF已成为开展药物靶标结合的动力学分析、高通量高亲和力化合物筛选最受欢迎方法之一。

       生物医学科研实验，HTRF技术在受体与配体、蛋白与蛋白、蛋白与核酸间的结合及作用机制分析等得到广泛应用。它是激酶活性检测，如丝氨酸、苏氨酸激酶(serine/threonine kinases，STK)活性检测、细胞膜G蛋白偶联受体(G-Protein Coupled Receptor， GPCR)的信号转导机理（如G蛋白级联反应/G-protein cascades）和功能分析（细胞中IP1或cAMP定量），蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI），基因表达调控，表观遗传学（如组蛋白修饰活性），细胞因子，炎症、代谢性疾病及神经系统疾病中异常信号通路生物标志物分析（如人脑tau蛋白聚集）等研究的重要手段。

       2019年以来，几乎每年Acta Pharm Sin B都有HTRF应用文章发表。2022.01-2022.08，就已刊发了多篇中国医学科学院北京协和医学院、清华大学、沈阳药科大学、中山大学科研团队的HTRF检测应用有关报告。                                              

       本文尝试讨论以下4个问题：1）HTRF技术对其它同类荧光测定方法的独特优势；2）HTRF技术对测试仪器有何特殊要求；3）将HTRF技术用于激酶活性分析等分子互作实验过程中多功能荧光酶标仪的选型策略；4）HTRF与其他TR-FRET测定技术在检测程序上的兼容性。

一、HTRF分析与TRF、FRET、TRF-FRET技术和而不同

       青取之于蓝而青于蓝，冰水为之而寒于水。

       HTRF技术源于TR-FRET技术，但在TRF镧系元素荧光材料应用、FRET近红外荧光标记的选择和荧光信号校正方法三方面都有重大创新发明。

1.1 新型镧系阳离子穴状化合物荧光供体的应用

       镧系元素也称稀土元素（Rare earth element），如铕(europium, Eu)、铽(terbium, Tb)、钐(samarium, Sm)等，对紫外可见光吸收弱，难以被直接激发产生检测效用的荧光。通过镧系阳离子自身的配位化学键，与有紫外吸收功能的有机化合物配体结合，组成中心为镧系阳离子、外围为有机配体、具有特殊构象的配位化合物。外围配体吸收紫外辐射能量后传递给位于中心的镧系阳离子，后者即可发射斯托克位移（Stoke's shift）大、峰形窄，寿命长的荧光（这种现象称为“天线效应”）。

        三价阳离子Eu³⁺ 、Tb³⁺ 、Sm³⁺的配位数多达8-9个。不同配体与镧系阳离子构成的配位化合物复合体构象存在复杂多样性。不同复合体空间构象在减少周围介质环境发光淬灭效应、维持荧光稳定性效用存在差别。

        而样品溶液中的生物大分子（如核酸、蛋白质芳香残基），乙二胺四乙酸（EDTA）、具有环状结构的有机配体等，或因与镧系阳离子结合敏化镧系阳离子发光，或因淬灭作用，会改变荧光发射特性。

       常规TRF分析中的荧光标记物多为Eu³⁺、Tb³⁺螯合物（Chelates）。复杂样品基质成分干扰，溶液温度和pH值条件的波动、高浓度的Mg²⁺等金属阳离子以及EDTA、二甲基亚砜（DMSO）等添加剂的存在，常导致镧系元素螯合物荧光检测信号很大不稳定。

       HTRF技术的FRET荧光供体为有特殊空间构象的穴状化合物Eu³⁺ cryptate、Tb³⁺ cryptate。它们是以含2,2'-联吡啶基团（2,2’-bipyridine groups）的巨多环（macropolycycic）外围骨架作光吸收配体、中央空腔嵌入镧系元素离子构成的。其笼状结构可为结构中心的Eu3+ 、Tb3+离子提供强大保护。而联吡啶基团的结合有助于分子内高效能量转移和提升量子效率。特别是采用Eu³⁺内核时，标记物在生物介质中具有优良的动力学稳定性，对样品基质和溶液成分的耐受力极强。无荧光漂白现象，可允许连续数日对同一样品进行多次重复测定。因此，不仅可用于荧光强度的终点测定（Endpoint measurement），还适用于样品荧光的动力学分析（kinetic measurement）。这是普通镧系元素螯合物TRF试剂难以实现的。

1.2 高效能FRET能量受体XL665和d2的应用

       荧光共振能量转移（FRET）利用能量供体（Donor）、能量受体（Acceptor）两种荧光基团，分别标记有可能相互结合的两个生物分子。生物分子发生结合后，其携带的Donor、Acceptor得以靠近到10nm以内。此时，供体与受体之间产生能量共振转移，供体部分能量转移给了Acceptor，后者吸收能量即发射荧光。样品将会被同时检测到两种荧光信号：一种是能量供体被检测光源激发后释放的强度较强、峰值620nm荧光，另一种是受体发出的强度较弱、峰值665nm红色（或520nm的绿色）荧光。相反，如待测的两种生物分子间未发生结合，标记供体、受体的两个荧光基团因空间距离过大将无法发生FRET，受体将处于静默状态，无荧光释放，此情况下，只检测到发自供体的一种荧光。

       FRET技术优势在于，实验中无需将未结合的、游离状态的检测分子移除，无需洗板步骤直接测定，简化了操作，且有利于整合移液工作站、储板机和多功能荧光酶标仪，实现全程自动化、高通量FRET检测。

       HTRF技术中，FRET荧光受体有两种，即XL665和d2。二者分子量不同，荧光光谱特征完全相同：不仅半衰期非常长，激发波长620 nm，发射波长665 nm,Stroke's shift > 300 nm,发射光谱处于红外区，可进一步降低生物溶液中其它生物分子本底荧光干扰。XL665即别藻蓝蛋白（Allophycocyanin, APC）为超灵敏荧光染料，具有极高的量子产率，比传统有机荧光团灵敏度高百倍。d2是第二代FRET能量受体用荧光标记物，分子量较小，可减少空间位阻对实验的影响。

1.3 FRET双荧光比值校正法的应用

       HTRF与其它TR-FRET产品的区别还在于对两种荧光测试值的专利比值处理方法。

       测定620 nm供体和 665 nm受体发射的两种荧光强度后，用665/620（受体/供体）的比率计算Delta F（%），表示每个样本的FRET能量转移率。

       专利的比值测量校正了孔与孔间因移液误差所致的样品填充量差异、不同样品浓度或测量仪器激发能量波动引起的误差，并消除来自测定组分的介质干扰和淬火带来的干扰。这个归一化处理措施，提高了灵敏度并降低测试值的CV%。(待续)