赤橙黄绿青蓝紫 谁持彩练当空舞——双荧光素酶报告基因检测之多功能荧光酶标仪方案-下

基于应用的多功能荧光酶标仪选型-2

 （续：双荧光素酶报告基因检测之多功能荧光酶标仪解决方案-上）

二、DLR检测对测试仪器性能的特殊要求

       在萤光素酶（如萤火虫萤光素酶，海肾萤光素酶或NanoLuc萤光素酶）催化底物氧化的反应中，的确也存在420nm波长附近的发信号光峰，但整体光谱分布范围极宽泛。如只选择最大发射峰检测而滤掉其他波段的信号，则会造成发光信号大量损失。此外，真核生物来源细胞、组织等不发光或样品自身的背景荧光信号极低。故在萤光素酶检测中，应尽可能地收集整个可见光谱（380–650 nm）信号，避免使用光栅、滤光片装置滤除来自样品信号，以确保检测的灵敏度。这是DLR检测跟鲁米诺类衍生物的酶促反应发光等其他化学发光、BRET/NanoBRET生物发光等检测上的重要区别。

       DLR检测的化学反应过程中，海肾萤光素酶与萤火虫萤光素酶催化反应的发光信号强度有效范围一般可达6-8个数量级。

       资料显示，使用纯化的萤火虫和海肾萤光素酶混合物、Promega GloMax 20/20发光检测仪测量发光信号，萤火虫萤光素酶报告基因酶的检测极限为1×10^-21 mol萤光素酶，海肾萤光素酶的检测限约3×10^-19 mol海肾萤光素酶。

表1 Promega公司发光检测仪的测试性能参数

       表1显示：Promega自创各型号发光检测系统，PMT的感光波长范围达到了350–700nm，测试线性范围至少覆盖8个数量级，测试灵敏度低至1×10^-21 mol荧光素酶（约0.002 amol/well,96孔）。

       此外，DLR检测需在白色多孔板上进行，是为更好地收集发光信号，并减少孔间信号的窜扰。

       同时，无论是基于光栅光路还是基于滤光片光路的发光检测系统，都不适用于DLR检测。

表2  品牌微孔板测读仪发光检测性能参数

       对比表2所列的几款发光酶标仪、多功能荧光酶标仪在发光测定的性能指标可发现，因检测器线性动态响应范围、检测灵敏度差异，并非市面所有多模式微孔板检测仪都可胜任DLR检测。

       Promega 推荐使用经DLR认证的检测系统（带有 DLReady标识，系统软件整合了标准DLR检测应用程序）进行DLR检测。无论是单管发光检测仪或微孔板发光读板仪，建议配备两个试剂进样器，以实现两种试剂交替操作的无缝衔接。

三、用作DLR检测的多功能荧光酶标仪经济型方案

       目前，市面取得DLReady认证的发光检测仪、发光酶标仪类产品屈指可数。

       物以稀为贵。

       无论一次只能进行单管测定的GloMax 20/20，还是可以96孔板批量测定的GloMax Navigator发光酶标仪，都售价不菲。国内公开信息显示，GloMax Navigator售价高达4万美元，已跟经典滤光片光路类多功能荧光酶标仪市价比肩。

       因此，购置GloMax Navigator发光酶标仪，则不如考虑带荧光、发光和光吸收功能的且具有DLReady认证的多功能荧光酶标仪(注：有数十个机型可用，详见promega英文网站有关内容)。

表3  部分DLReady认证的品牌多功能荧光微孔板测读仪

品牌 型号	BMG Fluostar Omega	MD SpectraMax iD3	Tecan Infinite F Plex	BioTek Synergy HTX
外观
检测器	Side-on PMT	-5℃ PMT	PMT	PMT
测定样品类型	6-384-well plate	6-384-well plate	6-384-well plate	6-384-well plate
读取位置	Top/Bottom read	Top-read	Top-read	Top-read
检测发光类型	Glow/Flash	Glow/Flash	Glow/Flash	Glow/Flash
波长范围	240～740 nm	300 - 650 nm	/	300～700nm
检测下限 (mol 荧光素)	20 amol/well ATP	10 pmol/well ATP	225 amol ATP/well (9 pM;384孔板)	60 amol ATP/well
检测动态范围	>9 logs	>7 logs	/	>6 logs
孔间光串扰	/	<0.1% (半量96孔白板)	<0.1% (半量96孔白板)	/
注射器数量	2	2	2	2
注射器移液范围	3～500μl (±1μl)	1～max (±1μl)	最大800μl (±1μl)	5～1000μl (±1μl)

       表3所列4个机型中，Tecan Infinite F200 PRO系列Infinite F Plex为单一滤光片光路架构，同时具有荧光、荧光偏振、发光检测功能的荧光酶标仪（无光吸收测定功能）。

       BMG Fluostar Omega和BioTek Synergy HTX均为双光路架构，即同时具有光栅光路（用于光吸收测定）、滤光片光路（用于荧光、发光检测，其中滤光片轮中预留有发光检测专用的空滤光片位，避免了滤光片对发光型号的过滤阻拦）。

       MD SpectraMax iD3与Fluostar Omega、Synergy HTX不同，其光吸收、荧光检测波长的选择是由光栅单色器（而非后二者采用的经典滤光片光路）完成的，发光检测模块则采用了单独检测光路。

       基于《荧光强度检测的多功能荧光酶标仪方案-下》的观点，采用相同功能配置时，SpectraMax iD3的售价将会高于Fluostar Omega、Synergy HTX市价。而Infinite F Plex，尽管采用的是滤光片光路，但因FP功能模块存在，市价将绝非四款机型中的较低者。

参考文献：

［1］E1910 和E1960 Dual-Luciferase Reporter Assay System 技术手册中文版(2020,CTM040)

［2］GloMax 20/20 Luminometer Instructions For Use (Rev 11/12)

［3］GloMax Explorer System Operating Manual (Rev 6/22)

［4］Omega Family of Readers Operating Manual (Rev G)

［3］Instructions for Use for Infinite 200 PRO（Rev 1.6）

［5］SpectraMax Mini Multi-Mode Microplate Reader User Guide (5090339 B)

［6］SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader User Guide（5054747 H）

［7］Synergy HTX Operator's Manual (Rev A)

［8］Simon T.M. Allard,  Kevin Kopish. Luciferase Reporter Assays: Powerful, Adaptable Tools For Cell Biology Research. Cell Notes, 2008, Issue 21.