生物医学样品微量紫外光度测定的技术原理和方法-下

 (续：生物医学样品微量紫外光度测定的技术原理和方法-中)

五、Implen NanoPhotometer液滴压缩技术

       通常，低盐样品（脱盐后的蛋白溶液）、非极性溶剂、去污剂（如SDS、Triton X100）残留或样品温度升高，均可导致液体表面张力显著降低。依赖液体表面张力维持样品的测试光路稳定的方法，很容易因溶液张力特征变化而致液柱拉伸失败，造成测试误差或难以获得有效数据。特别是纯化后的蛋白质样品，表面张力低同时基质成分复杂，微量蛋白质的可靠测量向来都是充满挑战的任务。

       德国Implen公司是业内微量紫外可见光度计领域仅次于NanoDrop的著名厂商。所开发的NanoPhotometer系列微量紫外可见光度计全部采用的是由铰链可开合密封上盖和可控制升降的样品基座组成的密封性检测池。上盖正中为石英玻璃反光镜，基座中央为石英玻璃光学测试窗。样品滴加到检测窗口，测试光束从底座的测试窗向上穿过样品后抵达顶盖，被反光镜反射后折回，再次通过样品、测试窗口进入检测器。上下两个石英表面间距的2倍即测试光程的长度。微量测定功能的核心原理是独特的液滴样品压缩技术（Sample Compression Technology）。

       所谓样品压缩技术是指：测试液滴添加到检测池中测试窗口，放下密封上盖后，液滴夹在基座、顶盖反光镜之间被挤压成薄膜。膜的形成是测试表面对液体的物理挤压所致，与液体自身的表面张力属性无关，彻底摆脱测试光路对表面张力的依赖。而薄膜厚度可由底座的升降运动来控制，调整基座高度即可控制膜的厚度，即实现对测试光程的调节。                                              

       Implen采用两个固定的锚点来定义路径长度（True Path控制技术）。如图所示，基座在锚点1时，基座-镜面间距大，测试光路径长。基座停留在锚点2时，基座-镜面间距缩小，液滴更趋扁平，此时测试路径较短。基座升降由磁铁控制只能在两个固定锚点之一定位，无法在除两个锚点之外的任何位置停留。这样确保了测试光程的精确设定，而不发生漂移。

       NanoPhotometer微量紫外可见光度计还为核酸和蛋白质的测定引入了自动光程设定功能（Automatic Path Length Setting）：通常，先在较长光程下测量，根据测得的样品吸光度，判定样品是否在路径长度的有效线性范围内。如样品浓度超出该范围，仪器将自动以较短的路径长度重新测量。系统自动选择适宜光程，确保测量结果的准确性。

Implen NanoPhotometer微量紫外可见光度计测试光程表

六、其他微量紫外光度测定技术和方法

6.1 NanoPhotometer测定原理类似技术

       德国Hellma公司的Traycell 2.0，是专为紫外可见分光光度计标准检测池架开发的、可用于微量核酸蛋白样本测定的石英比色皿。

       将样品滴加到比色皿顶部的光学窗口，上盖，与配套比色皿适配器组合后，安装到标准检测池架即可。测试完成，简单擦拭比色皿光学窗口和上盖，即可进行下一个样品的测定。使用方法上，与NanoDrop One/One C、Implen NanoPhotometer NP80/60/50系列微量紫外可见光度计如出一辙。加样和清理样品残留时，无需从检测池架上取出TrayCell比色皿，比色皿与测试光束的相对位置始终保持不变，以测试结果的可重复性。

       TrayCell比色皿由主体部分（相当于NanoPhotometer的样品基座）、带反射镜的密封盖组成。主体部分嵌入光纤，用于传导测试光束和接收样品检测的信号。因此，其工作原理、结构设计与Implen NanoPhotometer颇有相似之处。

       测定前，比色皿需要一定的准备操作：

       通常情况下或预估样品浓度较低时，首先用1.0mm的光程测定。选择较薄的适配器（安装到比色皿底部）和数字标示为10的上盖（测定吸光度值相当于标准10mm比色皿测定值之1/10，相当于样品进行了10倍稀释）；

       测定浓度较高的样品时，直接采用0.2mm光程方案测定，选择安装较厚的适配器和标示50的上盖（表明其稀释因子为1:50）。

       测试光程（即样品层厚薄）不同，所需最低样品体积存在一定差别：0.2mm光程的TrayCell容量为0.7 - 4μL，1mm光程的TrayCell样本容量为3 - 5μL。

       给比色皿添加适配器，在eppendorf BioSpectrometer 系列分光光度计的microcell、日立UH5300紫外微量测定模块使用中，都是规定动作。

6.2 NanoDrop测定原理类似技术

       这类产品首推eppendorf开发的Cuvette G1.0微量比色皿。

       G1.0由铝外壳和带疏水性涂层的石英玻璃夹层制成，光路长度1 mm，测定样品体积范围1.5–10μL，主要涉及用于高浓度核酸和蛋白质样品的检测。

       G1.0的测定原理、点样操作与NanoDrop OneC类似，都是借助测定界面的疏水作用和液体表面张力维持液柱和测试光路的稳定，光束与液柱法中轴重合、穿透样品层后进入检测器完成测试。每个样品测试结束，简单擦拭检测窗口清理。

       Cuvette G1.0与TrayCell两种比色皿均直接安装于标准10mm光程检测池架上使用。G1.0点样时须从检测模块上取下，在桌面完成移液后，重新插回检测池中。但G1.0上样前无须适配器安装，操作更简便。Cuvette G1.0的售价与国产Nano 400这类固定波长的微量紫外可见光度计整机价格旗鼓相当。但若Hellma TrayCell比， G1.0收的智商税还算有点良心。

参考文献：

［1］Eppendorf μCuvette G1.0 Operating instructions

［2］Instructions for use UVette universal adapter

［3］Model Uh5300 Spectrophotometer Instruction Manual (Edition 1)

［4］NanoPhotometer N120/NP80/N60/N50/C40 User Manual (Version 4.3.3)

［5］NanoDrop One Micro-UV/Vis Spectrophotometer User Guide (Revision E)

［6］NanoVue Plus Product User Manual (REV 1.4)

［7］Traycell 2.0 Quick Start Guide