生物医学样品微量紫外光度测定的技术原理和方法-中

 (续：生物医学样品微量紫外光度测定的技术原理和方法-上)

四、NanoDrop系列微量紫外分光光度计

       吸光度计算公式A =ε·b·c表明，在一台光度计上测试同一个样品，选用不同测试光程，则A260测定值不同。理论上，1.0mm光程的A260读数相当于10mm光程模式读数的1/10。若采用更短的0.1mm光程测试，A260读数会进一步减小至标准光程的1%。

       将上述计算公式转换一下，得到：

       c = A/(ε·b) ……................................. 公式2

       公式2表明，同一台光度计、采用长短两种光程，分别测得的2个样品A260读数相同时，短光程测定模式对应的样品实际浓度，要高于长光程测定模式下所测定样品的真实浓度。

        换言之，在同一台光度计检测器的线性检测范围内，短光程测定模式提高系统的吸光度测定范围、样品浓度测定上限。以Implen NanoPhotomete NP80、N60微量紫外可见光度计和C40常量紫外可见光度计为例：NanoVolume功能模块（光程0.67mm/0.07 mm两档可调）与标准10mm光程比色皿测定模块比，吸光度范围上限和可测样品浓度上限提升了125倍以上（2-3个数量级）。

       因此，高浓度样品适合用短光程模式测定，而较低浓度的样品可以尝试采用标准10mm、1.0mm或0.1mm光程来检测。这样做目的是使吸光度读数尽可能落在仪器检测器吸光度线性响应区间，减少误差，提高测试精度。

       新型微量紫外可见光度计的1mm光程相当于常规紫外可见光度计标准10mm比色皿检测光程的1/10。理论上，其可测的样品浓度上限相当于标准比色皿测定上限的10倍。若要进一步提高可测样品浓度上限，进一步压缩样品检测光程是一行之有效的办法。

       PCR反应体系构建过程中经常用漩涡振荡来充分混匀样品，而同时使PCR管内壁出现大量大小不等的液滴挂壁吸附。如此小的液滴，须离心处理才能将其回收。

       或许受此启发来的创造灵感，Charles W. Robertson等人在2000年创建NanoDrop Technologies公司（已并入赛默飞公司），专门研究如何利用液体表面张力特性开发一款可利用0.5 ~ 1 μL体积样品完成核酸测定的工具。功夫不负有心人，其首款产品NanoDrop 1000于2003年上市，获得了巨大成功，并由此掀起了一场席卷全球的Drop-Style设计思潮。

       由于液体表面张力作用，微小液滴可在一定尺度内被任意拉伸成高度、粗细不同的双曲面柱体。测试光束从柱体中轴穿透时，光程长度可以被精确控制。这样，不仅实现了将测试光程长度压缩到1.0mm以内的目标，还可以进一步划定0.05mm、0.02mm、0.01mm等更多个亚毫米级的短光程。

NanoDrop系列微量紫外可见光度计检测光程表

       通过多光程自动调节（auto-ranging），从而在应对各种高浓度样品测试挑战时，从容不迫、时游刃有余。

       NanoDrop微量紫外可见光度计的光程auto-ranging具体细节，从官方资料无从可考。不过，原GE health care开发NanoVue Plus（现归Biochrom公司）的技术资料，可让我们窥视光程自动调节的一些端倪。

       NanoVue Plus有0.2mm或0.5mm两档测试光程可选：较低浓度样品应使用0.5mm的光程，较高浓度的样品应使用0.2mm的光程。在DNA、RNA、寡核苷酸、Tm计算、Cy染料、蛋白质紫外光和蛋白质A280方法中，由于事先样品的浓度范围未知，系统默认采用自动调整光程的功能选项。

       自动光程功能激活后，仪器首先进行样品的0.5mm光程测量，如测得的吸光度高(>1.7A)，则系统自动调整为用0.2mm光程重新测量样品，直至测试纸落入系统检测器最适测定区间。在该功能模式下，样品的扫描总是先后使用两个光程进行。

       测试后的样品浓度等，系统自动进行路径长度和吸光度归一化化(Pathlength and Absorbance normalization)处理，最后给出相当于标准10mm光程的修正值。

（待续）