美人首饰侯王印尽是沙中浪底来——牛人用伯乐CFX Connect实时荧光定量PCR仪都干了啥？-下

 (续《牛人用伯乐CFX Connect实时荧光定量PCR仪都干了啥？-上》)

8、lncRNA、microRNA表达分析和RNAi沉默验证（6篇）

       长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类不编码蛋白，长度可达200碱基的RNA分子。它们可通过与DNA、RNA及蛋白质结合，参与基因转录前、转录中、转录后（与转录物形成互补双链干扰mRNA的剪切）及转录后翻译与蛋白质磷酸化等过程调控，影响干细胞重编排、细胞分化。

       qRT-PCR测定特定组织和细胞中LncRNA表达水平，可分析LncRNAs 的差异表达模式。同时测定lncRNA和编码基因的mRNA表达水平，可找出表达显著相关的lncRNA-mRNA对。而基于lncRNA与mRNA表达相关性及lncRNA与mRNA编码基因位置关系，可推测lncRNA对靶基因的调控功能。

       研究人员采用CFX Connect荧光定量PCR仪，分别对软、硬基质条件下培养hPSCs的内胚层分化阶段特异性基因的诱导、LINC01356、LINC00458的表达水平的检测结果表明：下调的LINC00458显著抑制内胚层特异性基因FOXA2和SOX17及EOMES和GATA6的mRNA水平，表明LINC00458在内胚层响应软底物的分化中发挥重要作用，而LINC00458缺失会影响内胚层基因表达，提示它对软底物诱导的内胚层分化不可或缺。采用ChiP-qPCR方法对含有内胚层特异性转录调控因子SMAD2、SMAD3 siRNAs的hPSCs中RIP复合物中LINC00458、MAL581的检测表明，软基质培养诱导LINC00458与SMAD3相互作用。研究结果提示：软底物诱导的LINC00458是通过SMAD2/3依赖途径调节hPSC内胚层的特化。

9、植物基因研究（6篇）

       CFX Connect实时荧光定量PCR仪被用于研究植物组织发育中起调控基因（如MADS-Box-基因、homeobox gene同源盒基因、光感受器基因）特异性表达模式、植物形状控制等位基因鉴定和植物特殊发育阶段基因QTLs分析等。

10、基因突变的检测（5篇）

       实时荧光定量PCR用于SNP基因型分析和拷贝数变异(CNV)检测属于常规经典应用。

11、NGS基因测序文库的定量（4篇）

       NGS测序所用起始样本核酸质量和靶标富集方法不同，使测序文库浓差异极大。而文库核酸样本的精确量化和归一化，将确保每个合并文库测序所需深度，所有样本达到所需的测序reads量。用实时定量PCR仪和SYBR Green对经多重PCR反应制备富集的测序文库片段定量，测定文库准确浓度是NGS分析流程中文库质控的关键步骤。

12、ChIP-qPCR检测（2篇）

         染色质免疫沉淀法（Chromatin Immnoprecipitation，ChIP)是一种基于抗原与抗体免疫杂交原理，用特异性抗体对染色质上结合的组蛋白、蛋白修饰物、转录因子、辅因子等特定抗原和与抗原结合的DNA片段实现分离富集的实验技术。
        ChIP-qPCR技术则是融合ChIP和实时定量PCR技术各自所长。利用抗体特异性富集与特定转录因子、组蛋白修饰结合的DNA 片段，以qPCR仪、SYBR 荧光染料对与特定蛋白结合共沉淀的DNA的定量分析。该技术可原位、真实地反映目的蛋白或蛋白修饰在特定基因位点的分布和丰度，查找在靶基因启动子上转录因子结合的证据，是分析蛋白之间相互作用、组蛋白修饰对基因表达的影响等重要技术手段。ChIP-qPCR基本检测流程包括：固定处于特定细胞周期的活细胞→染色质剪切为不同长度范围的小片段→利用抗原抗体反应对染色质免疫沉淀→蛋白结合的DNA片段纯化→qPCR检测。
        德国马普分子生理学研究所的研究人员对在减数分裂中联会复合体（synaptonemal complex，SC）Pch2（pachytene checkpoint 2，一种细胞减数分裂过程粗线期的细胞周期检查点蛋白，属AAA+ ATP酶）在起始识别复合物（Origin Recognition complex，ORC）结合位点募集机制的研究中，借助于ChIP描绘出减数分裂G2/前期Pch2染色体关联图谱，揭示了Pch2在整个基因组中的特异性结合位点。用CFX connect实时荧光定量PCR仪对处于减数分裂G2/前期阶段的ndt80Δ 细胞中 GAP1、TDH3、PPR1 三个转录活性基因位点、各自编码区的下游和上游DNA序列进行了 ChIP-qPCR 分析。实验结果表明，Pch2的染色体募集具有减数分裂特异性和RNA聚合酶II驱动的基因转录活性区域依赖性，Pch2分子中的非催化功能NH2端结构域(NTD) 是Pch2招募到染色体所必需的结构。

13、其它方面的应用（4篇）

13.1 非天然碱基半合成生物体基因表达的检测

       加拿大Scripps研究所的研究人员采用非自然的碱基对(unnatural base pair, UBP)合成了一种可储存遗传信息并能稳定表达的半合成生物体(semisynthetic organism, SSO)。对含UBP碱基质粒DNA的检测用的是CFX Connect实时荧光定量PCR仪和SYBR Green标记法。

13.2 差示扫描荧光法（Differential Scanning Fluorimetry）

       差示扫描荧光法，亦可称为蛋白热稳定性分析（Protein thermal shift），是利用实时定量PCR仪缓慢升温熔解实验，根据熔解过程中实时荧光变化，对多个基团结合而成化合物或生物大分子的热稳定性评价，用于筛选能与靶点结合的小分子药物、抗体等。测试依托的正是实时荧光定量PCR系统的HRM分析功能。

       研究人员采用SYPRO orange染料在CFX-Connect 系统上完成了与胱硫醚β合成酶 ( cystathionine βsynthase, CBS )为靶点的富含杂环杂芳香族结构的小分子化合库筛选。

13.3 降落实时荧光定量PCR分析应用

       国内学者报道了基于降落PCR（touchdown PCR）原理开发的降落实时荧光定量PCR分析（Touchdown qPCR Assay）方法。采用CFX-Connect结合EvaGreen 或SYBR Green分别按常规双温循环法qPCR、Touchdown qPCR法对低丰度样品检测对比试验结果显示，确认了后者在检测灵敏度、扩增效率上的明显优势（了解touchdown PCR参考《扩增条件再优化在实时荧光定量PCR实验中的意义和有效途径-下》）。

13.4 染色体构象捕获-实时荧光定量PCR分析(3C-qPCR)

       人们在基因表达调控研究中关注到的是基因及上下游调控元件线性排列顺序。而即有证据表明，染色质之间相互作用，基因表达可被处于立体空间一定距离范围的远程调控元件所调控。

       染色质构象捕获（chromosome conformation capture, 3C）技术正是为研究基因调控相关元件在染色质内空间内分布而建立的。其指导思想是：空间相隔一定距离的增强子和启动子等基因组元件，能通过染色质片段间相互作用被带入到基因的特定区域，调控临近位置的基因转录。位置相近、可相互作用的两个染色质片段内的DNA片段因此而连接，形成一个DNA的unction reads。对被分析的两个目标基因片段设计引物，将这两个区域嵌合而成的junction reads扩增，根据PCR产物评估目的片段之间相互作用关系的有无和强度，可找出与不同转录因子作用的转录元件及调控靶区。分析两个片段在的基因组区域和染色质上定位，即可得到DNA间、染色质区段间相互作用关系图谱。

       3C主要操作流程包括：与ChIP-qPCR类似细胞甲醛固定染色质结构→限制性内切酶将DNA酶切→DNA连接酶对片段末端连接、蛋白酶K消化所结合的蛋白质，获得含有相互接触DNA片段→实时荧光定量PCR检测，获得染色质不同位点相互接触数据，分析得出相互作用染色质的三维分布图谱。

三、关于CFX Connect实时荧光定量PCR仪引入科研实验的思考

       迄今为止，与CFX Connect实时荧光定量PCR仪有关的公开研究论文还不到200篇。因经验和对qPCR实验目的理解的偏差，本文对qPCR实验应用的归类难免有不妥之处。但不可否认，CFX Connect在实际应用中所跨越深度和广度，已基本触及到目前基于实时荧光定量PCR技术所能开创的空间极限。一款仅配置有双荧光通道的系统，其展现的应用实力，与任何高配、高价、高端荧光定量PCR系统比，都已毫不逊色。这一事实，足以让人震惊。

       美国哥伦比亚大学内科和外科医学院Gerard Karsenty团队中一名叫Jianwen Wei的学者，2015-2016年间，作为第一作者连续在Cell、Cell Metab上发了2篇文章。因实时披露美国新冠疫情信息在我国如今已是妇孺皆知的约翰霍普金斯大学，其下属一研究团队实验室用的也正是是CFX Connect实时荧光定量PCR仪。某种程度上，也似乎暗示：就实时荧光定量PCR分析实验而言，仪器荧光通道数量多寡，可能并非决定实验成效的关键因素。就调研所揭示的想象看，CFX Connect的性能表现，对于渴望在Cell、Cell Metab、Nucleic Acids Res、Nat Ecol Evol、Nat Struct Mol Biol、Nat Commun、J Exp Med、Sci Adv这档顶流学术论坛留名的人们来说，是够格的。

       实际上，伯乐CFX Connect实时荧光定量系统的技术性能，在目前国内外同类产品中足够硬核。这一点，《慧眼识珠看伯乐CFX connect实时荧光定量PCR仪》有专门讨论。结合调研所披露的事实和CFX Connect与国产同类产品趋同的售价，在当前科研仪器建设投入偏紧的新形势下，重新审视实时荧光定量PCR仪规划，对于充分发挥仪器建设的财政支持效能、减少不必要浪费，无疑具有积极引导意义。

       进口品牌中与CFX Connect同一档荧光定量PCR仪还有一款，就是ABI的QuantStudio 1（QS 1）。QS1系统检测模块配置三个荧光通道（它抛弃CFX Connect中鸡肋般的FRET通道，换上了JUN、ROX、Texas Red染料通用检测通道）。这对于多重实时定量分析发烧友而言，上triplex qPCR实验都已不在话下。虽然CFX Connect、QS 1都用的96×0.2mL热循环模块， 但CFX Connect的模块最大变温速率5.0℃/秒，显然完胜QS 1系统的3.5℃/秒。本文没有选QS1作为范例予以讨论，是因截止至发稿，我们都无法确信在PubMed数据库中收集到足够数量的与QS1有关的qPCR实验文章。

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