美人首饰侯王印尽是沙中浪底来——牛人用伯乐CFX Connect实时荧光定量PCR仪都干了啥？-上

一、小CFX Connect实时荧光定量PCR仪在大牛手里表现不俗

       CFX Connect是伯乐CFX系列实时荧光定量PCR仪的基础产品，可用于2重实时荧光PCR分析和FRET双杂交探针荧光检测，2012年3月上市。PubMed数据显示:从美国马里兰州陆军研究实验室“球状芽孢杆菌Spo0F H101R突变对菌株适应性的影响(Effect of the Bacillus atrophaeus subsp. globigii Spo0F H101R Mutation on Strain Fitness)”的研究报告公开发表的2012年11月，到2022年3月的10年间，用CFX connect进行的qPCR实验总计已发表论文186篇（剔除预印本平台已发表的一篇），其中IFoid分7.0以上期刊发文总数45篇（占比近25%）。

表1 部分用CFX Connect实时荧光定量PCR仪开展实验的研究论文（2015-2022）

二、CFX Connect实时荧光定量PCR仪已开展的研究应用

       单从文章数量上看，CFX Connect实时荧光定量PCR仪用户略显得小众一些。莫非是因CFX Connect的荧光检测通道数量少，限制了其功能应用灵活性的缘故？

       事实并非如此！

       在PubMed上，我们查阅了这186篇正式刊文，对其中qPCR实验内容部分逐一核实，并按荧光定量分析所直接服务的阶段性实验目标进行归类。结果显示，CFX Connect所涉及的实验应用类型超过13个。按各类别下发表文章的数量排序，结果如下。 

1、基因表达水平定量分析（42篇）

       常规基因表达分析应用包括肿瘤、炎症、自身免疫疾病、内分泌和代谢疾病等疾病病理状态下、应激反应、饮食/药物/治疗干预、环境胁迫（热胁迫、电离辐射）、CRISPR介导的基因破坏后、动植物组织细胞及微生物的标志性基因表达水平的变化。

       基因融合（gene fusion）是指因染色体易位、中间缺失或染色体倒置等导致两个基因部分序列嵌合形成一个新的突变基因。实时荧光定量PCR分析是对融合前原来两个基因设计特异性引物进行的各基因表达的mRNA进行检测。奥地利研究人员在对核孔蛋白NUP98的融合蛋白在白血病发生过程中所处地位的研究中，分别对用慢病毒载体搭载NUP98核孔蛋白- KDM5A组蛋白去甲基化酶5A融合基因转染的HL-60细胞、急性髓细胞性白血病(AML)小鼠表达的mRNA进行了定量分析。

2、细胞发育/分化/增殖/浸润/凋亡标志基因的表达分析（38篇）

       这部分实验主要包括调控细胞（含免疫细胞、肿瘤细胞）诱导发育、分化、增殖、凋亡、浸润功能有关信号通路（Wnt通路、Notch通路、MAPK通路、p53/p21通路等）关键基因、细胞发育各阶段标志基因表达的分析。

       RNA结合蛋白（RNA binding protein，RBP）Lin28家族包括LIN28A和Lin28B两个成员，具有相似的结构域和功能，可以维持细胞不断增值、去分化。micorRNA分子let-7在线虫胚胎不同发育阶段过渡中或在细胞分化过程中起到切换开关的关键作用。Lin28可抑制低分化细胞中let-7前体miRNA加工为成熟let-7 miRNA。而Lin 28A/Lin 28B是let-7 miRNA的直接靶点，通过Lin28基因3’-UTR区抑制lin28的表达。lin28与let-7存在双负反馈调节作用。

       内耳耳蜗内的感知机械震动的毛细胞(Hair cell, HC)的丢失是导致人类耳聋的主因。HC和支持细胞(Sertoli Cell, SC)源于一共同的祖细胞池-前感觉细胞。耳蜗前感觉细胞的分化和增殖依赖于Notch、成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)、骨形态发生蛋白(BMP)和Wnt/β-连环蛋白信号通路的复杂调控。在有丝分裂后期，最终分化为HC的前感觉细胞上调螺旋-环-螺旋转录因子ATOH1，对HC分化至关重要。其余前感觉细胞则由Notch信号介导发育成SC。Wnt/β-连环蛋白信号的过度激活或Atoh1表达的异位激活，会刺激新生小鼠/组织中的耳蜗SC重新进入细胞周期并形成新的HC。而抑制Notch信号则可诱导SC转化为HC。

       约翰斯霍普金斯大学研究团队实验表明，祖细胞特异性Lin28B和卵泡抑素(follistatin, FST)的短暂激活，将成熟耳蜗SC重编程为祖细胞样细胞，使从听力正常的幼年小鼠中分离出的耳蜗SC具备再生能力，在体外增殖形成新的HC。Lin28B驱动SC重编程的同时，FST可平衡Lin28B对转化生长因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β)信号的过度激活。证实Lin28B和FST共激活启动SCs的HC再生，可能是内源性修复机制的主要调控因子。实验中，对包括毛细胞（Atoh1、Gfi1、Pou4f3、Scx、Twist1）、毛细胞骨架蛋白MYO7A、Fst、启动多能性(Hmga2、Trim71)、Lin28家族（Lin28a、Lin28b）、干细胞表面标志Sox2、Notch信号调节基因Lfng（lunatic fringe）、骨形态发生蛋白家族（Bmp2、Bmp4）、转化生长因子β超家族（Inhba、Tgfb1、Tgfb2、Tgfb3）等在内的26个功能性基因的表达进行的检测，就采用了CFX-Connect和SYBR Green荧光染料标记的方法进行。

3、干细胞发育分化机制研究（26篇）

       诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS）是指向体细胞中导入特定基因或基因产物，诱导细胞重编程而得到的具有和胚胎干细胞类似的发育多潜能性的一种细胞类型。iPS具有可持续增殖能力并可分化成各种细胞，在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等与胚胎干细胞极为相似，可分化成人体各组织器官的细胞类型。在疾病模型的建立研究、细胞治疗、新药研究等具有重大潜在应用价值。

        扬州大学研究人员从黑羽狼山鸡中分离鸡胚成纤维细胞（CEF），转染Oct4/Sox2/Nanog/Lin28A四种诱导基因后，将CEF重新编程为诱导多能干细胞（iPSCs），这些干细胞通过BMP4 / BMP8b / EGF进一步诱导分化成原始生殖细胞（primordial germ cells， PGC）后，将其移植到白普利茅斯洛克鸡胚胎中，产生功能性精子或卵细胞。通过自交产生具有供体特征的189/509体细胞衍生的鸡。证明了从体细胞克隆禽类的可行性。对iPS的四个多能性标记基因Oct4、Sox2、Nanog和Lin28A表达情况的分析实验，用的是CFX Connect实时荧光定量PCR仪。

4、药效毒理作用和药效靶点分析（17篇）

       实时荧光定量PCR技术在药物研究方面的应用主要集中在3个方面。

       一是药理作用分子机制分析（如药物作用对靶信号通路中关键基因、药效指示基因及细胞增殖分化关键分子表达调控），二是药物作用靶点分析（如对基质金属蛋白酶-9），三是其次还被用于疫苗免疫原性评价、中药提取物的安全性评价。

5、微生物检测与鉴定（15篇）

       CFX Connect实时荧光定量PCR仪在细菌研究中应用，包括对16SrRNA基因丰度测定评价细菌适应度、细菌代谢功能基因测定、环二鸟苷酸(c-di-GMP)调控、转基因的检测等。病毒检测（如市政废水中SARS-CoV-2病毒）、真菌检测也有报道。

6、生物标志物研究（12篇）

       生物标志物一般是指可以标记系统、组织器官、细胞及亚细胞结构或功能改变或可能发生改变的生化指标，如核酸、蛋白质、酶、糖类以及体内发现的生物活性分子等，常用于疾病诊断分类，判断疾病分期、发展及严重程度，评价新药或新疗法的安全性及有效性，以及用于预测个体发病风险和高危人群临床筛查等。

       CFX Connect实时荧光定量PCR仪被用于对SARS-CoV-2感染的严重程度和预后的预测标志物（白细胞介素-3）、结直肠癌基因表达特征（MSI、BRAF突变和MLH1启动子甲基化）、食管鳞状细胞癌放化疗疗效的预测生物标志物（MMS22L）、巨噬细胞中LPS诱导的炎症标志物、肺纤维化致病标志物和治疗靶点的检测。

7、药代动力学基因多态性和耐药基因检测（7篇）

       一般认为，药物体内代谢、转运及作用靶点基因的遗传变异和表达水平变化，会影响药物的体内浓度和药物反应的个体差异。药物基因检测结果可用于指导临床个体化用药、评估严重不良反应发生风险和指导新药研发和评价。

       CFX Connect实时荧光定量PCR仪被报道用于真菌、细菌、肿瘤治疗药物的耐药基因检测以及药代动力学相关基因的多态性的研究中。

(待续)