慧眼识珠看伯乐CFX connect实时荧光定量PCR仪

       伯乐CFX Connect 是继CFX96 Touch之后，在2012年推出的具有三个荧光检测通道的基础型实时荧光定量PCR仪（注：CFX Connect已于2022年5月停产，由新款CFX Duet取代）。它沿用了伯乐荧光信号光学检测单元、PCR热循环反应模块二合一结构设计，可实现在一个循环中进行2重荧光PCR反应（multiplex real-time PCR assay, multiplex quantitative PCR， multiplex qPCR和罗氏 FRET双杂交荧光探针检测。可用于核酸定量（nucleic acid quantification，如SARS-CoV-2感染筛查与诊断）、基因表达水平分析（gene expression analysis）、基因突变检测(如常用的SNP、CNV、QTL)、转基因检测（genetically modified organism，简称GMO，如检测转基因大豆、玉米、棉花等）及PCR扩增产物的特异性验证分析（melt curve analysis、HRM assay）等多种研究应用。

      CFX Connect所用的96×0.2mL PCR模块的最大升温降温速度、模块内温度均一性、温度准确度、退火温度梯度优化功能等PCR反应模块关键技术性能，与伯乐CFX96、CFX96 Touch 实时荧光定量PCR系统所用的反应模块保持一致，与AB 7500 Fast（96×0.1mL）、QuantStudio 5（96×0.2mL）和QuantStudio 6 Pro（96×0.2mL）的常用配置一致或接近。

伯乐-AB主流qPCR仪主要技术性能指标对比

      从荧光检测模块类型看，CFX Connect、CFX96、CFX96 Touch和2020年新上市CFX Opus 96，都采用可移动、逐孔扫描的光梭式检测单元。读取荧光信号时，设定的荧光通道由光梭牵引动到每个反应孔中心正上方并短暂悬停，完成荧光激发和反应孔内样品发射荧光信号收集。光梭式检测模式消除了反应孔间的荧光交叉干扰（Cross-talk）和不同反应孔与荧光探头之间的角度和光程差。因此，反应板不同位置的荧光测试信号无需ROX染料校正。这一点，所有CFX系列荧光定量系统相通。
      就检测的灵敏度、动态范围、可重复性这些关键性能而言，CFX Connect与CFX Opus 96、7500 Fast、QuantStudio 5、QuantStudio 6 Pro等多荧光通道平台，并无本质差异。
      CFX96、CFX96 Touch和CFX Opus 96配置的是6个荧光检测通道（5荧光+1 FRET专用通道），而CFX Connect的检测通道仅3个（2荧光+1 FRET通道）。但高低两种光学配置的CFX系统，都有效支持SYBR Green I染料、TaqMan荧光探针（FAM、VIC、TET、HEX、CAL Fluor、Gold 540、Cal Fluor和Orange 560）、Molecular Beacon探针和1种FRET探针实验应用。对实验者而言，CFX Connect检测通道数量减少，牺牲的是多重实时荧光定量PCR分析中每个循环中可检测靶标的容量（单管内可同时测定的荧光探针标记靶标种数从3-5种降低为2种）。但CFX Connect系统依然可以进行FAM靶标+VIC内参组合这种最常见的双重实时荧光定量分析（duplex qPCR）。而CFX Opus 96、7500 Fast、QuantStudio 5、QuantStudio 6 Pro这类多荧光通道配置平台理论上可胜任三重、四重的多色荧光定量分析任务，这对于临床医学、流行病学中呼吸道、消化道感染性疾病复杂病原菌的快速鉴别固然有利。但众所周知，3重及更多种靶标的多重定量反应实验，反应体系的优化与特异性、灵敏度验证工作十分繁琐和复杂，绝非科研实验等闲事宜（多重实时荧光定量分析的涵义与应用意义和实施方法的问题，可参考《如何用MIQE标准指导多重实时荧光定量PCR实验的流程与验证设计?-上》）。从时间-效率比角度来说，CFX Connect的双重荧光定量分析功能是完全实用、够用的。这一点，目前已有大量实验论文可以证实（可参考《美人首饰侯王印尽是沙中浪底来——牛人用伯乐CFX connect实时荧光定量PCR仪都干了啥？-上》一文）。
      退一步说，对于特殊类型研究课题，确需开展单管内多种模板测定分析时，另辟蹊径，引入新型Green核酸染料高分辨率熔解曲线分析技术路线，CFX Duet完成5重以上的多重荧光定量分析也是完全可以实现的。
      至于CFX Connect实时荧光定量PCR仪明明配置了3个检测通道数，为何只能进行2色荧光同步检测的问题，可参考《实时荧光定量PCR仪荧光检测通道数量的内涵浅析》一文，在此不作赘述。