ImageJ软件Smoothing算法的涵义及在Western Blot条带定量中运用初探

让ImageJ在Western Blot图像分析中绽放-8

       在ImageJ软件Subtract Background设置面板中，Disable Smoothing选项是其中一个事关选区背景扣除和分析结论成败的关键性条件。
       本文接续Western Blot条带分析中如何设置ImageJ软件的背景扣除选项的话题，讨论Disable Smoothing设置和运用方法。
       要掌握Disable Smoothing的要义，首先须弄清ImageJ图像分析软件中Smoothing的涵义。   

一、ImageJ用户指南对关于Smoothing功能的说明

1.1 ImageJ用户指南关于Smooth命令描述
       ［29.1 Smooth］：Blurs the active image or selection. This filter replaces each pixel with the average of its 3×3 neighborhood；
      ［29.11.5 Mean］：Smooths the current image by replacing each pixel with the neighborhood mean.
      【归纳起来，Smooth命令是一个用于对当前活动图像或选区模糊处理的滤镜功能。其模糊算法的原理是，将每个像素的强度值用其邻近3×3区域内像素的平均值来取代。】
      ［29.14 Subtract Background］：For calculating the background (‘rolling the ball’), images are maximum filtered (3×3 pixels) to remove outliers such as dust and then smoothed to reduce noise (average over (3×3 pixels).
      【Smoothing命令用于采用滚球算法计算选区背景时，采用邻近3×3像素区域的平局值替代该像素实际强度值的方法，滤除图像中因灰尘、实验背景等所致明显高于周围3×3像素范围均值的异常像素，使图像的背景过渡平缓。】
      Image J软件主界面，当鼠标在当前激活的工作图像掠过时，状态栏会实时显示鼠标所在位置像素的强度值（pixel intensities）和X-Y坐标值（coordinates）。
      如图1所示，状态栏同时显示以鼠标当前所处像素为中心的左、右共三个像素B (x28,y16)、A(x29,y16)、C(x30,y16)的强度值。

       红色标识的像素A(x29,y16)自身原始图像强度值为129（本例为图像灰度值）。
      按Smoothing算法，以像素A为中心，把其上、下左、右相邻共9个像素圈选形成一选区（见图2），区域内像素强度均值代表像素A的图像强度值。
 

       图2显示，正方形活动选区共包括9个像素，强度均值Mean为131.4，即像素A的smoothing计算值。显然，smoothing值大小会因A像素位置而异。

1.2 ImageJ指南关于Disable Smoothing选项设置的说明
       ImageJ指南同时暗示了图像背景扣除条件并非必须采用Smooth一个算法。如背景扣除中确须禁用Smooth算法，则需勾选【Disable Smoothing】选项。
      Disable Smoothing的涵义与Smoothing正好相反。ImageJ指南关于Disable Smoothing有如下描述。
      ［29.14 Subtract Background］：With Disable Smoothing checked, the unmodified image data are used for creating the background.
      【如选中Disable Smoothing，则依照原始图像数据而非滤镜处理后图像数据来创建选区背景。】
      Check this option to make sure that the image data after subtraction will never be below the background.
      【勾选Disable Smoothing选项，以确保扣除背景后的图像数据不会低于背景信号强度。】

二、关于Smooth和Disable Smoothing算法涵义的疑问
       从指南以上关于Smooth和Disable Smoothing的介绍看，要完整清晰地理解Disable Smoothing算法还存在诸多疑点。这些问题的澄清，对在Western Blot条带图像分析中合理运用或禁用Smoothing算法，无疑具有积极意义。
       首先， Smoothing用3×3像素区域均值取代图像中强度值异于邻近像素的算法，实现削峰填坑。对于背景较为均匀的图像，剔除个别、细小异常像素，无疑可确保图像背景计算更合理。但Western Blot实验条带图像中，背景均匀分布的理想状态不多，而条带边缘与强度较高的大片背景区密切接触、或条带被背景带斜穿的情形反而更常见。此时，采用Smoothing算法是否适用？
       其次，指南指出了采用Disable Smoothing算法可以确保扣除背景后的选区像素强度值不会低于背景信号强度。但前提必须是，选区边缘部分像素信号强度要高于或等于背景像素，否则纵然有Disable Smoothing加持，减法做完后，边缘像素有效信号也是“资不抵债”。这是否暗示：在基于图像灰度值分析时，暗底白带型Western Blot条带图像是DSM背景扣除算法的理想适用对象？
       最后，Western Blot条带图像分析中， Disable Smoothing和Smoothing两种相反的背景扣除算法，其作用功效到底有何区别？是应该针对不同图像背景条件可以按照“一带一景”原则择优录取，还是二者只有一个算法是适用的？
      为解决以上疑点，我们通过实测，探究两种算法在WB条带蛋白丰度定量分析的实际表现和对分析结果的影响。

三、将Smoothing和Disable Smoothing算法运用于WB条带分析实测
3.1测试目的和方法
      据《ImageJ创建Western Blot条带分析选区的基本规则》一文介绍的方法和流程，采用《在Western Blot条带定量分析中图像灰度值的应用实测》文中所用的有代表性的条带信号-背景分布图像，采用相同滚球半球，分别采用Smoothing（简写为SM）和Disable Smoothing（简写为DSM）背景扣除选项，测试引入两种背景算法对图像扣除的表观效果和选区分析结果的影响。
      主要步骤和方法包括：
      (1)点 击【process】→【Subtract Background】菜单，调出Subtract Background面板；
      (2) 勾选Create Background（don't sunbtract）生成SM组图像背景，通过【Plot profile】命令，生成SM组背景信号曲线图谱。
      (3) 在（1）步骤后，勾选Create Background + Disable Smoothing选项，生成DSM组图像背景，再生成DSM组背景信号曲线图谱。
      (4) 将SM组、DSM组图像背景曲线图叠加比较，结果证实，SM组背景曲线的起点和整体水平明显高于DSM组曲线。

3.2 图像表征情况的对比
      条带1的ROI分别用SM、DSM两种算法扣除背景后，图像发生的变化见Fig.3。

      从图3看，SM、DSM两个测试组图像的区别是：
      图像ROI边缘如图3红色标示区域，SM组图像呈现出内外跨界、集中连片信号强度“消失”的景象（测试显示，像素强度值为1-3范围，肉眼难以辨识）。而DSM组选区内同等位置像素图像强度下降但依然处于可视状态。
      最关键的是，直观观察感知SM组的图像整体亮度低于DSM组。而ImageJ的Meaure测试结果显示，SM组Mean值、IntDen值分别为33、16435，而DSM组Mean值、IntDen值分别为35、17197；SM则测试值低于DSM组，这与肉眼辨识的结论一致。
      据Rolling ball算法原理，在滚球半径相同情况下，相同ROI，SM组测试值低于DSM组，唯一合理的解释便是：SM组的滚球起点更高而抬高运行轨迹整体水平，与信号强度曲线更近，造成了背景扣除程度更多保留信号更少所致。

      SM组测试值低，说明该算法所得的选区背景强度高于DSM组生成的背景。

       考虑到SM计算值因采样像素所处周边像素信号-背景条件格局不一而异。我们选择常见的代表性条带类型，进行进一步测试。

3.2.1 峰形完整型条带

      β-actin-B1条带的图像信号分布曲线走势平缓自然，图像背景匀和，背景强度较低。

       背景扣除结果（Fig.6）显示，SM算法生成的背景曲线起点和终点值均不仅明显高于DSM组的背景曲线起止点信号值，并且曲线轨迹整体与DSM组轨迹分离。

3.2.2 背景稳定型条带

      Clarity Max-B3条带背景强度较高，条带信号峰左右两翼有拐点，末段均呈现平缓、平直走势。综合图像背景分布情况，把像素列1-14设定分析选区。

      结果（见Fig.7）显示，SM组背景信号曲线最低点在末端，该值与DSM组曲线的起点几乎处于同一高度。

3.2.3信号中等背景强势型条带

      Clarity Max-B5条带的特点是信号主峰两翼均有拐点，拐点外围信号曲线呈现反弹上扬走势。未经甑别而以演示测试为目的，以拐点为界设置ROI，出现选区外背景信号高于选区边缘信号的情况。

      Clarity Max-B5测试结果（见Fig.8）显示，SM组背景信号曲线末端最低点信号值，都高于DSM组曲线的起点强度值。

3.2.4 信号弱背景强势型条带

      Clarity Max-B9这样条带整体特点是，图像信号弱而背景强，条带走势不规则，曲线折点处像素信号明显低于折点外围，ROI边界判别充满挑战。

      以测试为目的，对这一类条带暂以这点为界设立分析选区。背景扣除结果，类似于Fig.8。SM组曲线走势明显高于DSM组。

      测试进一步证实，SM算法生成的选区背景强度整体上高于DSM组算法背景。当选区外图像背景强度高于选区内图像信号时，SM算法生成的背景曲线将明显高于DSM算法所得曲线。
      基于有限的测试结果得出的初步结论是：在暗底白带型Western Blot图像条带分析中，SM算法的选区分析值低于DSM算法测试值。

四、讨论
       诚如《在Western Blot条带定量分析中图像灰度值的应用实测》指出的那样，在CCD结合ECL化学发光检测技术应用于直接Western Blot实验检测日益普及的现状下，采用图像的灰度值，直接对暗底白带型原图构建选区进行条带定量分析，被证实是合理可行的方法之一。
      以上测试和此前类似大量实测都观察到，在ImageJ软件Subtract Background设置面板中，Disable Smoothing选项与背景扣除滚球半径，是对选区分析值产生巨大影响的两个关键控制条件。因此，其设置与否，在分析中不可忽视。即便不影响实验分组间显著性差异结论的做出，它也会在事实上影响了分析数据的准确性，改变组间量化对比关系。
      Subtract Background的图像背景校正的默认设置是Smoothing算法。而基于目前经验，在对暗底白带型WB条带图像的分析中，Disable Smoothing算法引入的分析值高于Smoothing算法测试值。
      按Smoothing算法规则，在计算特定选区图像背景值时，软件是将选区边缘两列像素背景理论值与选区外的第一1列图像初始强度值平均后作为选区背景计算的起止点。计算的结果，从测试结果看是背景值明显抬升，有效信号强度自然会被削弱。特别是当我们遵循《ImageJ创建Western Blot条带分析选区的基本规则》，认定选框外为图像背景的基础上，后续对据此建立的分析选区采用Smoothing算法对背景扣除加码，显然是不合理的。
      基于实测，我们分析，ImageJ软件默认的Smoothing算法并非WB条带定量分析的必然选项。相反，我们的经验证实，Disable Smoothing算法用于暗底白带型WB实验图像的条带分析，不仅可行，且数据准确性更高。
      实际工作中，由于Western Blot实验操作和实验条件的系统性问题，当实验图像背景复杂，条带外形不规律等，造成选区创建中难以准确有效界定选区边界的情况，确认ROI选区内仍残留有背景成份的情况下，采用Smoothing算法，作为弥补单纯采用ROI设置排除背景缺陷的补充手段，应有助于消除选区背景的干扰。因此，应用于实验数据的初步评估有一定参考价值。

参考文献
    ［1］ImageJ User Guide (IJ 1.46r)
    ［2］在Western Blot条带定量分析中图像灰度值的应用实测(上)