图像旋转操作对Western Blot条带定量分析影响的评估与对策

让ImageJ在Western Blot图像分析中绽放-9

       曾有Photoshop培训师课堂提过，将图像以90°或90°的整数倍数进行图像的旋转、水平翻转、垂直翻转后，对图像无损。但若以其他角度旋转，则会损害图像品质。
       无论Photoshop还是ImageJ等专业图像软件，自带Image Enhancement工具，可实施图像的Adjustment, Rotate（旋转）, Flip(对称翻转)，Resize（大小缩放）等多种调整操作。软件是通过不同图像插值算法（可简单理解为对原图像中所有像素通过某种算法模型计算，按计算结果为新像素赋值的方法，对图像像素重新布局的方法），对全部像素进行了 “异地搬迁重建”,会不同程度损害图像质量，如图像边缘锐度和图像像素强度。
       Western Blot实验中，会经常出现条带排列位置倾斜的现象。在WB条带蛋白定量分析时，对图像旋转修正，是否会影响条带的分析值？条带图像倾斜有何建议和防范对策？   

一、实测ImageJ对Western Blot图像旋转对条带的影响

1.1 图像来源：详见《在Western Blot条带定量分析中图像灰度值的应用实测》相关内容。
1.2 图像准备：将Clarity Max.tif用ImageJ软件中【Image】→【Transform】→【Rotate】菜单命令，选择双立方插值（bicubic）设置，按+1.6°、-3.6°和-10°旋转图片后，分别保存为Clarity Max-Rotate 16.tif，Clarity Max-Rotate 36，Clarity Max-Rotate 100.tif备用。
1.3 选取各组中的条带3，分别构建3个分析选区。
       以条带3中轴线和中心为参照，如图1-1所示，采集图像不同部位代表高、中、低信号强度的像素，按《ImageJ创建Western Blot条带分析选区的基本规则》方法统计这些单像素选区的图像灰度值。

表1  旋转前后条带的像素点图像灰度值测试结果

       表1数据显示：
      1）同一个条带上相同位置像素，旋转到新坐标点重构后，各像素强度值的还原程度不一。1.6°旋转组与原图组的测试数值接近或相同，而3.6°组和10°组数值存在较大误差，尤以10°组误差为甚；
      2）旋转重构误差效应在图像中强、中等、弱信号像素群都存在。
      调用【Plot Profile】分析模块，对3个旋转组进行Plot分析，结果见Fig 1-2。
 

       图1-2显示，随着图像旋转角度从1.6°、3.6°加大10°，选区图像信号强度分布形态发生改变。
      1）峰值从原图的142.6变为142.7，139.2和130，变化幅度随着旋转角度加大而加大。同时，峰顶由偏态过渡至对称状态，最后出现钝化呈现偏态有调整迹象；
      2）峰的一侧曲线末段走势转平缓，图像强度值升高；
      3）选区范围增大，选区宽度从最初13个像素扩充为14个像素。
      4）旋转后，条带主体部分的面积变化不显著，但选区左右两侧像亮度较低区域形状、面积都有明显不同。同时，选区右下角的强背景干扰区与选框相对位置发生变化。
      在条带3的Plot Profile分析结果观察到的现象，还重复发生在同组的其他条带上（见Fig.1-3和Fig. 1-4）。

      各组间条带5选区范围一致，但峰值、峰顶行转有所区别，同样可见一侧曲线末段斜率增大现象。

      各组间条带9选区分布范围、峰值和峰顶均有明显变化，一侧曲线边缘部分斜率增大。
      Plot Profile分析表明，将Western Blot条带图像以小小角度旋转，等于条带经历了一场变革：
      1）旋转重构像素值的误差，不仅改变了条带主体的像素强度信号，也改变了条带周围图像背景像素群的信号分布。条带还是那个条带，但选区分析的目标像素群则已物是人非；
      2）构成条带的主体部分，作为选区内图像强度值最高的像素群，原来高度集中分布在有限的几个像素列。旋转后的条带从竖直或接近竖直状态逐渐倾斜，使高强度信号像素由中轴线向条带两侧水平分散，使条带峰值下降，峰顶外形（峰值、峰度、偏度）转变。同时，还造成条带边缘部分像素列信号强度增强，以及弱信号条带信号分布范围的扩张；
      3）条带旋转改变了图像强背景信号团块与条带边缘部分的接触状态，部分弱信号像素得以在Plot Profile图中被“激活”而“归队入列”；同时，条带边缘弱信号像素因陷入图像背景包围而被排除出选框。不同旋转状态，使选区内有效检测信号像素群的“纯洁度”有了差异。

二、图像旋转对Western Blot条带选区统计分析值的影响
2.1 ROI建立
      参考《如何用ImageJ为Western Blot条带定量建立分析选区》的方法，分别为Clarity Max组、Clarity Max-Rotate 16组和Clarity Max-Rotate 36三组图像全部条带创建ROI。按《Western Blot条带分析中如何计算ImageJ的滚球半径？》介绍方法，核实ROI选区背景扣除滚球半径，采用《在Western Blot条带定量分析中图像灰度值的应用实测-上》相同背景扣除设置选项条件和统计值处理流程。观察旋转前后各组条带选区分析值的变化。

2.2选区初始值统计结果

表2  组间选区图像初始值表

      表1数据显示，原图、顺时针旋转1.6°和逆时针旋转3.6°三个组各选区Area、Mean、Min、Max、IntDen均出现不同程度的变化。其中：
      Max值变化，提示条带信号最强部分像素的强度值旋转后没有完全复原；
      Mean值变化，提示条带整体亮度发生改变；
      Area值改变，说明旋转后条带信号强度分布范围出现变化。
      将各组的测试值与同组内测试值相对稳定的条带4测试值的比值，绘制成散点图见Fig.2-1。

      图2-1显示，与各组图像初始IntDen比值的差异比，校正背景后组间差异被明显放大。整体上看，原图组与旋转1.6°组的曲线轨迹较一致；而3.6°旋转组的曲线走势差别明显，这或许与组中条带3、7、8、9测试值的剧变有关。

      图2-2显示，原图组与蛋白初始载量组分析数据比值的指数趋势线高度吻合；1.6°旋转组趋势线指数方程常数与蛋白初始载量组接近；但3.6°旋转组曲线则有明显偏离。
      实测提示，条带旋转使目标条带ROI统计像素群的强度类型，像素数量都可能发生改变，结果导致选区IntDen值产生误差。虽然Western Blot条带图像旋转角度大小与选区分析值误差程度的关联还有待进一步观察。但图像小角度旋转对Western Blot条带选区定量分析产生影响是可以肯定的。因此，在Western Blot实验需要准确评估组间量效关系时，对原始图像旋转后再分析的做法应尽量避免。
      实验中应力争使条带的图像规整，无疑有利于提高分析的精准度。

三、在Western Blot实验中如何解决条带图像倾斜对分析结果的干扰
      Western Blot实验由于电泳、电转实验环境条件、实验规程和实验者操作经验技术等软硬件差别，电转获取的图像中的条带排列的不规整现象极为常见。
      追根溯源，在WB实验流程中，实验室创造必要硬件环境，无疑是确保转印膜上条带图像水平规整行之有效的手段。
      就目前资源而言，有两种硬件保障措施是可以考虑的。

2.1 用Gel Alignment Template帮助凝胶和转印膜摆放位置规整
      Gel Alignment Templates，凝胶样品成像定位板或称为样品中心对准模板，用来快速、精确地定位ChemiDoc MP和ChemiDoc Imaging Systems成像系统的样品托盘上的凝胶和转印膜样品。
      外形如同相框，框的外侧与样品台成像区大小匹配，而框内尺寸与实验室常用的凝胶尺寸一致。模板安装到样品台后，只需把待成像样品摆放到框内，框-样品四周实现严丝合缝，避免出现倾斜现象，从而确保样品摆放方方正正，所有条带的图像保持同一水平位置。
      模板分为mini和midi两种规格，凝胶或转印膜通用，与Bio-Rad开发的样品托盘完美匹配。

2.2 配置带样品自动调节功能的Western成像系统
      赛默飞英捷品牌的蛋白免疫印迹成像系统样品台没有伯乐成像系统那样的样品定位板，但却配置可自动调节的旋转样品台。
      Invitrogen iBright CL750、iBright CL15 Western Blot凝胶成像系统及iBright FL1500 Western Blot凝胶多功能成像系统标配的自动机械式旋旋转载物台，能自动识别样品摆放位置，并能自动将样本顺时针或逆时针方向旋转10°，提前修正样本位置。
      这个功能同样可使图像中条带的位置保持水平一致。这样有效避免在成像采集完成后软件实施数字旋转操作，从而最大程度保持图像数据的原貌完整性。

参考文献
    ［1］在Western Blot条带定量分析中图像灰度值的应用实测-上
    ［2］ImageJ创建Western Blot条带分析选区的基本规则
    ［3］如何用ImageJ为Western Blot条带定量建立分析选区