ImageJ软件中Sliding Paraboloid的涵义及在WB条带分析中的应用初探

让ImageJ在Western Blot图像分析中绽放-7

      《 Western Blot条带分析中如何计算ImageJ的滚球半径？》提出，ImageJ软件Subtract Background设置面板中的Sliding Paraboloid和Disable Smoothing两个选项的设置，对Western Blot条带图像定量分析数据可靠、精准十分重要。
       本文尝试探索Sliding Paraboloid算法的涵义，为其在Western Blot条带蛋白定量分析中的合理运用提供理论依据。

一、关于Sliding Paraboloid算法涵义的理解

       关于Sliding Paraboloid选项，ImageJ用户指南有如下描述：
       if checked, the ‘rolling ball’ is replaced by a paraboloid that has the same curvature at the apex as a ball of that radius.
       Nevertheless, the ‘sliding paraboloid’ is also an approximation, since it does not use a in fact paraboloid but it rather slides parabolae in different directions over the image.
       ［备注：在进行图像背景扣除条件的设置时，勾选Sliding Paraboloid选项后，软件将把该圆球半径应用于轨迹顶点弧线曲率半径，构建平滑的抛物线模型取代圆球模型，把虚拟抛物线轨迹纵横方向上所触及的信号强度范围通通视为背景，从图像原始像素强度值中予以扣除。］
       The ‘sliding paraboloid’ typically produces more reliable corrections since the ‘rolling ball’, a legacy algorithm (only kept for backward compatibility), is prone to edge artifacts.
       ［备注：平滑抛物线模型比经典圆球模型具有更可靠的背景校正效果。原因是经典圆球对剔除选区信号主峰两翼边缘末段部分背景时，容易残留背景信号（artifacts）。］
       指南目前，关于sliding paraboloid亟需澄清的关键问题包括：
       首先，edge artifacts到底是指什么，为何rolling ball经典算法存在edge artifacts的问题，而sliding paraboloid则可以有效克服？
       其次，sliding paraboloid既被视为rolling ball的迭代算法，它是否适用于Western Blot条带定量分析的背景扣除？
       再次， 软件虚拟的平滑抛物线到底是平抛线，还是弹道抛线线？
       最后，引入sliding paraboloid算法设置，到底对Western Blot条带定量分析结果有何影响？

       我们引用《在Western Blot条带定量分析中图像灰度值的应用实测-上》的一组实测结果，来逐一探究以上问题。

二、sliding paraboloid在Western Blot条带定量分析中的作用实测

       分析方法：对Clarity Max组Western Blot实验的条带2建立ROI（规定为初始值Raw组），采用软件默认smoothing设置（规定为SM组）、smoothing叠加sliding paraboloid（SP）设置的（规定为SM+SP组），分别进行背景扣除，调用【Plot Profile】功能和【Measure】，观察组间选区图像有效信号强度分布、图像背景强度分布和分析统计结果的区别。

2.1 选区图像有效信号强度分布曲线变化

       图1是背景扣除前该Western Blot条带选区的图像信号强度分布的峰形图。图中可见，主峰左右两侧图像背景存在落差，信号走势曲线两翼的末段长而低平。从选区右侧边缘第13列像素开始，曲线突现转为低平，有明显拐点。

       从外形上分析，规整的圆球弧线难以与曲线末端良好接触，很可能第14列像素的背景扣除失真、失效的情况。

       图2是显示，经默认smoothing算法叠加经典Rolling ball算法生成背景并扣除后，信号主峰右翼边缘曲线出现“断裂”的痕迹，实际是曲线下限低于参考背景“地平线”而淹没在参考线一下所致。

       说明采用smoothing算法，使靠近处于选区外围的第14像素列信号强度高出处于选区内侧第13列像素信号强度的异常情况。

       图3是经默认smoothing算法叠加sliding paraboloid算法修正背景后，选区图像信号强度分布形势。结果显示，信号曲线末段，即选区内第14列像素信号曲线淹没于“参考地平线”以下。说明该算法扣除背景后，选区外围图像信号强度低于内侧像素的强度值，情况正常。 

       用Plot profile在对出现信号淹没的选区13-14列像素范围局部放大，发现SM组和SM+SP组，峰形曲线末段走势截然不同：图4显示的是SM组末端上杨，而图5则显示，SM+SP组的末端呈下行走势。

       根据条带信号强度分布一般规律和滚球背景扣除原理，ROI图像有效信号强度理应离ROI中心越远信号越弱，直至消失。据此判断，SM背景扣除方案对于该ROI选区不适用，而SM+SP设置方案则合理可行。

2.2 选区测试结果

       采用实测中条带1、条带2和条带6共3个条带的测试值，下表按顺序分别列出了各条带初始值、SM组和SM+SP组的测试值。

表1  WB条带SM和SM+SP组分析数据列表

       从测试结果看，所有条带，无论是SM组和SM+SP组，所建立的分析选区ROI的Min值均为0，背景扣除无明显异常，符合《ImageJ创建Western Blot条带分析选区的基本规则》的要求。
       所有条带的IntDen值，加入sliding paraboloid选项后，SM+SP组与SM组相比会升高。以条带3IntDen值为例，SM+SP组比SM组升高幅度达5.5%。

2.3 选区图像背景信号分布曲线

       ImageJ软件的rolling ball经典算法和sliding paraboloid，针对同一个分析选区计算后生成的图像背景有何区别？

2.3.1经典rolling ball算法生成的选区背景

       图6的信息显示，滚球算法生成的背景首、尾两端信号强度点分别为109.0 - 100.9。背景剖面类似于平抛线。
2.3.2 sliding paraboloid算法生成的选区背景

       图7显示，sliding paraboloid算法生成的选区背景首、尾两端信号强度点分别为108.9 - 101.2。

       对比可知，生成的抛物线两端落差略小，起点更低，止点高。提示，sliding paraboloid的末段离信号峰分布曲线更近，使得选区边界像素的信号更多被去除）。

       把两个背景剖名叠加后可以看出：sliding paraboloid背景顶部呈现的曲线整体走势更平缓，起点和中部更低平，曲线末段斜率略微减小；曲线以下空间（背景）小于滚球曲线。通俗地概括sliding paraboloid背景曲线特点就是，低头尾巴放低身段增信号。
       下面的图例源自此前Western blot条带图像实测分析中ImageJ软件平滑抛物线算法生成的其他图像背景信号分布曲线，具有一定的代表性，可以有助于将sliding paraboloid算法逻辑理解的形象化。

       从这些采用sliding paraboloid算法的Western Blot条带图像分析结果看，推测ImageJ软件会根据设定的ROI条件和sliding paraboloid设置，自动调整优化抛物线的位置，以便与图像信号曲线走势实现最优的匹配。

三、讨论

        因Western Blot实验中条带形状、信号强弱以及周围背景条件不一，使得条带分析选区图像信号强度分布Plot图千姿百态。 ImageJ图像分析软件所用的背景扣除圆球弧线和平滑抛物线算法，自身曲线走势特征，与条带ROI选区内边缘图像信号强度曲线之间的匹配程度存在区别。而信号曲线与背景扣除曲线之间距离大小，决定了图像信号中被去除与保留的程度不一。造成了两种算法对图像分析选区边界像素的背景扣除效果的区别。
       按照rolling ball算法原理，经典圆球对选区内部处于超长低平信号地带的像素背景扣除少而保留信号多，使得在背景扣除后，图像上ROI最外围像素呈现出异常升高，在Plot图上表现为曲线末段出现不连续（断裂）和末端抬头上翘现象，这无疑有悖常理。分析认为，这部分无法被滚球有效消除的残余背景信号，即是ImageJ指南中所谓的edge artifacts。我们称之为rolling ball算法的“边缘效应”。可预见的是，主峰两翼曲线末段越长、走势越低平，圆球背景扣除效果越差。
       而平滑抛物线末段比同等半径的圆弧线平直，使抛物线更有机会贴近强度信号曲线的末端，对于带有明显拐点的低平末段曲线匹配更好，因此对消除图像选区信号微弱的边界像素背景，有更好表现。我们把这种现象称之为Sliding Paraboloid算法的“边缘优化效应”。

       基于有限实测经验和数据可观察到，对暗底白条型Western Blot实验图像条带定量分析中，Sliding Paraboloid算法引入，往往会拉高ROI的强度积分值，还经常出现ROI的Min值大于0的情况。而大多数的条带，即便拥有低平信号末段的选区， rolling ball也可以实现背景扣除目的。因此，Sliding Paraboloid选项不是万能的，也非刚需。

       我们认为，Sliding Paraboloid选项在Western Blot实验条带定量分析背景扣除设置中，典型适用指征为：当选区图像强度主峰的边缘部分强度信号急剧衰减，Plot图上曲线急转低平并于出现明显拐点，可考虑采用平滑抛物线算法以便更有效地去除边缘像素的背景。
       我们建议：在评估ROI曲线走势和条带选区边缘背景基础值，确认末段曲线难以与圆球曲线匹配，且经Sliding Paraboloid算法修正后的图像信号曲线走势合理，则应该优先考虑Sliding Paraboloid算法的分析数据。

参考文献

［1］ImageJ User Guide (IJ 1.46r)