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Western Blot条带分析中如何计算ImageJ的滚球半径？
让ImageJ在Western Blot图像分析中绽放-6
《Western Blot条带定量如何确定ImageJ滚球半径？》提出，在WB图像条带定量分析中，扣除背景滚球半径值由条带短轴方向图像有效强度信号的分布范围大小决定。
根据《如何用ImageJ为Western Blot条带定量建立分析选区》提出的条带分析选区创建规则，ROI正是基于条带短轴方向图像信号分布范围来确定边界的，即ROI的宽度值等于条带短轴方向图像强度信号分布的范围。
现在的问题：滚球半径是否就等于条带选区宽度值？
要回答这个问题，还得从Rolling Ball算法原理和Rolling Ball Radius涵义说起。
一、准确理解Rolling Ball算法和滚球半径涵义
《为Western Blot条带分析背景扣除牛转乾坤的Rolling ball》文中指出，在Western Blot实验图像分析中，扣除背景的滚球半径小，图像信号强度被当作背景成份扣除的多。当半径缩小至不合理水平后，条带因大量有效信号强度被去除失，会大幅降低ROI统计值。而滚球半径增大，滚球与信号强度峰相切切除减少，峰中被保留的信号强度多，条带ROI统计值增加。但滚球半径进一步放大后，各条带检测值中背景“水份”剧增，滚球扣除背景效果弱化甚至失去作用。
既然rolling ball理论提出源于自然现象，滚球半径设计也应符合基本自然规律，确保其合理。
先看一幅采用多个WB条带Plot profile分析曲线图经裁剪、拼接、倒转后合成演示图（Fig. 2）。
图中3个信号峰，形态（峰度和偏度）各异，峰口边缘“地形地势”有别，各峰口跨度不一。三个滚球Rolling Ball -1，Rolling Ball-2和Rolling Ball-3，分别与Plot-1、Plot-2和Plot-3对应。
各滚球与峰口相应的支撑点相切。按照滚球算法原理，A、B之间的范围属于有效信号范围。从A、B切点各自向外侧的信号曲线，皆视为图像背景,不应纳入选区分析范围。
从图上看，Plot 2有Rolling Ball-2a和Rolling Ball-2b两个滚球。滚球2b半径过小，球体深陷峰内，且球体与峰口边缘地形走势并不匹配。反观滚球2a，与峰接触的圆弧与峰口外曲线的走势较匹配。因此，从简单的自然规律角度，即可认定滚球2a球体半径尺寸较为合理。
此时，弱采用比2a球体直径更大的滚球经过，则球-峰相切点位置会外移。此时，从2a滚球的角度看，更大球体的切点外移后，使原A、B外侧的图像背景被收罗进入新选区。按ImageJ指南中滚球半径是不包含图像背景前提下的有效信号分布最大范围尺度的规则，这明显与“背景勿入”相悖。
图中的球-峰切点A、B之间连线，代表峰口直径。不同峰口由于周围“地形”条件不同，对与之匹配滚球的半径尺寸要求理应不同。峰口直径越大，滚球半径相应也增大。
在《Western Blot条带分析中如何确定ImageJ滚球半径？》已用实际案例证明，在实际工作中，脱离峰型实情，盲目套用50像素“神半径”进行背景扣除分析的做法，是不合理的。
那么，在Western Blot条带定量分析中，滚球半径与选区宽度、峰口直径三者之间有何关联？
二、Rolling Ball、ROI宽度和峰口直径三者间几何学逻辑关系
将实测采用实际WB条带ROI的Plot Profile图垂直翻转后合成图4，有助于直观了解滚球半径与选区宽度、峰口直径三者之间的内在联系。
A、B两点为峰-滚球的两个切点。分别经过A、B引出图像横坐标轴和纵坐标轴的垂线后，两条垂直线相较于C点，则A、C、B三点够成一个直角三角形。三角形斜边AB长度代表峰口直径。CB对应信号峰的水平分布范围，即ROI宽度。
过AB中点M做AB垂直平分线，并任取O代表滚球圆心。则OA即该滚球的半径R,MO与OA夹角为θ。
滚球半径R与峰口直径AB的计算公式为：
图4和计算公式表明，AB长度确定的情况下，O下移至M点，此时θ为90°，滚球直径刚好等于AB时，滚球作用毫无意义；
圆心O外移，滚球半径增大，球体于峰内的弧线趋于平直，峰-球交集减少，峰内保留的有效信号强度增多。当滚球半径增长超出极限，圆弧线与接近AB线段无限接近，背景扣除部分剧减，去背景效应几近于询价，同样毫无意义。
因此，R取值范围并非存粹的数学计算问题，它是有“存在合理性”限制范围的。超出此范围后，滚球会失去应用价值和存在的必要。
按ImageJ指南描述内容，滚球半径R取值（“经验值”）范围是R≥AB。
而基于直角三角形边长计算公式，滚球半径R≥CB。
这就从原理上回答了本文开头部分提出的问题，即：滚球半径不应低于ROI宽度；它可以等于峰口直径。
此外，从图上看，几何知识还给了我们如下有价值的启示：
1）峰口直径长度（AB）不仅与选区宽度（CB）有关，还与AB两点高程落差（AC）有关。
2）AB的高程差，在Western Blot条带图像中，代表的涵义是条带短轴方向上图像背景信号强度差异。
相同宽度的条带，如选区ROI两侧背景强度落差不同，导致AB长度有区别，进而使滚球半径也发生改变（Fig. 2-1）。
此外，当ROI两侧图像背景强度落差小时或落差极小，意味着条带背景分布极其均匀，此时AB将无限接近CB，使得滚球半径实际上接近于ROI宽度。根据公式计算的AB值等于CB值的现象，在WB条带实测中确实屡见不鲜。
AB高程差与AB长度之间的有趣现象，再次验证了《为Western Blot条带分析背景扣除牛转乾坤的Rolling ball》和《在Western Blot条带定量分析中图像灰度值的应用实测》文中的观点，即：滚球半径不仅由带条本身信号分布范围尺度决定，同时还受到条带选区所处图像背景分布条件限制。
因此，在WB条带蛋白定量分析过程中，不同条带应采用“一带一景”分析法则。而所谓网红半径，是不切实际的想法。
三、Western Blot条带定量分析中滚球半径测算方法
实测中，我们采用直线工具法测算Rolling Ball半径值。即借助于ImageJ软件的直线工具length，直接测量AB长度值。
在Plot profile结果显示窗口中，选择工具栏的直线选区工具，以A为起点像B引出直线，工具栏下部会适时显示鼠标所在位置对应线段的长度值。
当鼠标移到B点时，请注意用键盘截屏功能，截屏保存软件测得的AB长度值。
如图Fig.5a所示，测得AB长度为9.50像素。
该方法操作直观简便，测量精度控制要点在于确保直线工具的起止点与曲线首位两端的高度重合。为此，可以将Plot profile显示窗口拉大，这样便于识别鼠标中心与曲线末端的对准程度。
但该方法缺陷是测算结果人为误差较大。引出的AB线段操作中，受电脑屏幕分辨率和屏幕大小、手工操作定位精准度影响，操作过程测量精度的控制有一定难度。因而不同场次操作中，ROI的统计数值往往存在小幅波动。
四、结语
因条件所限，目前还无法对《Biomedical image processing》的rolling ball algorithm理论方法作详尽研究，加之ImageJ图像分析软件应用于Western Blot条带定量分析的经验尚缺，目前提出的Rolling ball半径计算方法有效性还有待进一步检验。
滚球半径尺寸要基于具体的ROI计算。每个条带短轴方向的形态、背景分布存在区别，滚球半径计算值必然存在差异。这正是《为Western Blot条带分析背景扣除牛转乾坤的Rolling ball》所提的一“径”难求的道理。
“一带一景”分析策略，更适合应用于精确定量型Western Blot图像分析。因此，滚球半径不是经验值，是具体条带具体计算的亲测值。采用不切实际的统一滚球半径用于分析，无异于缘木求鱼，不仅有悖于ImageJ指南中提出滚球半径设定要求，甚至还将数据分析结果引入歧途。
至于本文开头部分提出的问题，总结的话就是：滚球半径值多数情况下等于信号峰的峰口直径二大于选区宽度值；只有当条带短轴方向的前、后缘图像背景均匀一致且强度落差很小时，峰口直径或滚球半径测算只等于条带宽度。
《ImageJ创建Western Blot条带分析选区的基本规则》提出ROI科学合理创建是分析工作成功的基础。原因就在于ROI创建后，条带分布范围、峰口形状都已界定，滚球半径值是木已成舟，呼之欲出。依托ROI计算Rolling ball半径，可以有效降低主观随意性和误差。
需指出，仅掌握滚球半径算法，对于Western Blot图像条带定量分析还不够。细心的读者或许已经注意到，在《图像灰度值在Western Blot条带定量分析中应用的实测-上》一文中，实施“一带一景”时，不同WB条带的分析选区除采用差异化的滚球半径值，还存在sliding paraboloid和Disable Smooth两个选项引入与否的问题。
如何为Subtract Background有效设置sliding paraboloid和Disable Smooth选项问题，留待《ImageJ软件中Sliding Paraboloid的涵义及在WB条带分析中的应用初探》和《ImageJ软件Smoothing算法的涵义及在Western Blot条带定量中运用初探》来讨论。
参考文献
［1］ImageJ User Guide (IJ 1.46r)
