Western Blot条带定量如何确定ImageJ滚球半径？

让ImageJ在Western Blot图像分析中绽放-5

      《为Western Blot条带分析背景扣除牛转乾坤的Rolling ball》提出，用ImageJ图像分析软件对Western Blot条带定量分析中，背景扣除用的滚球半径值设置的科学合理对分析结果产生重要影响。而半径设置应根据被分析对象在图像中的范围尺寸进行。

       本文从Western Blot条带图像信号分布的固有特征出发，来探讨基于条带短轴方向像素强度分布范围大小来确定Rolling ball半径方法的理论依据和在WB条带定量分析中应用可行性。

一、Westen Blot条带图像信号分布范围决定着条带强度分析结果

1.1 Western Blot实验条带的长轴长度较稳定
       Western Blot实验操作繁琐且环节众多，极大影响着实验结果的准确性和重复性。

       众所周知，实验条件（Buffer配方、工作温度及pH值等）、试剂耗材品质和具体操作细节上的人为差异，以及蛋白分子自身水溶性、等电点、分子量、表达水平等属性存在区别，造成不同实验室间、不同实验批次间WB条带图像存在很大区别。

       如条件许可，改进实验硬件配置和自动化程度，积极优化操作流程，无疑有助于提高WB实验结果的稳定和可靠性。譬如，如蛋白凝胶电泳用伯乐Mini-Protean Tetra蛋白垂直电泳槽，电泳梳统一为10孔10.mm或15孔1.0mm（可稳定电泳条带形态长度和蛋白初始载量）,转膜就来Mini-Trans Blot小型电转印槽或用带内置程序的Trans-Blot Turbo蛋白快速转印仪（稳定转膜条件和效果），抗原抗体免疫杂交按Merck Western Blotting检测加速器SNAP i.d. 2.0等预置程序进行（稳定检测条件和效果）,曝光成像统一为CCD分辨率910万像素的英捷iBright CL系列化学发光凝胶成像分析系统或630万像素的伯乐ChemiDoc Western ECL化学发光凝胶成像分析系统，采用优化的曝光设置（确保检测灵敏度、图像分辨率与条带尺寸一致）等。

       Western Blot实验采用相同实验条件和流程，排除转印等操作失误因素后，同一批次实验，10孔SDS-PAGE凝胶获得的Blot，条带长度差异不过1～4个像素。
       实测经验表明，条带分析选区的长轴适度延长1-3个像素，对ROI面积和IntDen值影响忒微。条带长轴长度并非Western Blot条带测试值的关键影响因素。

1.2 Western Blot实验条带的短轴方向分布具有条带特异性
       通常情况下，Western Blot实验图像上，条带亮度强度分布规律是从条带长轴中心顺着短轴一前、一后两个方向扩散分布并渐次减弱，直至淹没于条带背景中。

       经验告诉我们，条带宽度，会因蛋白表达丰度而存在显著区别。一般说来，电泳蛋白初始载量大，对应条带图像不仅亮度高，条带也宽。反之，图像中弱信号条带，往往伴随条带宽度的明显缩窄。

       为Western Blot图像条带创建分析选区中可发现，各条在带短轴方向强度信号分布范围的哪怕仅1个像素列的差别，会使ROI选区的像素数量（Area值）以数十的幅度猛增，而IntDen值则以千量级急剧放大。这就很好地解释了，肉眼看似条带差别不大，但统计结果差异悬殊的常见现象。
       可见，条带短轴长度与ROI的Area值和IntDen值均存在显著正向关联。
       说明，是Westen Blot条带短轴方向图像强度信号分布范围大小，左右着条带统计分析结果。   

       故应遵循电泳实验客观规律，抓准真正影响分析结果的牛鼻子。

       根据《为Western Blot条带分析背景扣除牛转乾坤的Rolling ball》的观点，Western Blot图像条带分析选区的背景扣除算法中Rolling ball滚球半径值，应当按照分析对象在图像中的分布范围大小来确定。

      显然，条带图像强度信号在短轴方向的分布范围，正是Rolling ball滚球半径值设定的首选参考标准。

二、基于条带短轴信号分布范围建立条带分析选区方法的实测验证

       实测目的是尝试解决以下三个问题：

       90°旋转后，是否会影响图像ROI的IntDen值？

       分别依照条带短轴和长轴模式创建ROI，分析结果是否存在差异？

       按短轴模式建立的ROI背景扣除设置是否可以移植到传统长轴分析模式中？

2.1 图片来源

       2020年发表于NATURE COMMUNICATIONS的ARTICLE《CLR01 protects dopaminergic neurons in vitro and in mouse models of Parkinson’s disease》中PGC1α的Western blotting实验图像，保存为.bmp格式。

2.2 图像处理准备

      1）通过反相处理，所得图像为条带长轴分析模式；

      2）反相后再进一步旋转90°处理后用作条带短轴分析模式；

      两幅处理后生成的新图分别保存为.tif格式备用。

2.3 图像ROI创建

      按《如何用ImageJ在Western Blot条带定量分析中创建分析选区》所述方法，依次实施条带ROI边界评估→创建ROI→保存ROI方案操作。

      本次在条带长轴、短轴两种分析模式下创建的两个ROI设置和分析条件见表1。

表1  条带长轴、短轴分析模式建立的ROI情况

2.4 ImageJ的Plot Profile分析

      依据条带短轴和长轴分析模式建立的两个ROI，实际是位置、大小完全的同一个选区。在同一个分析界面分别执行Measure→Plot profile，结果如fig. 4所示。

      Plot分析显示，采用短轴模式ROI的条带强度值分布呈现近似于高斯模型，灰度值范围为93-122。而长轴模式ROI强度值为不规则峰形，灰度值范围为88-114。

2.5 软件分析结果

      两个模式创建的ROI，分别执行Measure命令后，在同一个分析界面显示的IntDen值完全一致。提示，用ImageJ将图像旋转90°处理，相同ROI，IntDen信号值未见显著变化。

      将长轴与短轴两种分析模式的ROI，分别扣除背景后，执行measure命令后，结果如fig. 6所示。

      结果表明，两种模式的ROI，采用不同背景校正设置后，IntDen有效计算值相差极为悬殊。短轴模式ROI IntDen值为42589，长轴模式ROI IntDen值为48629.，前者仅后者的87.5%，差异显著。

      对长轴模式ROI分别采用长轴模式、短轴模式、混合模式的背景扣除方法，进一步对长轴ROI分析，结果见fig. 7。

      结果显示：

      1）长轴模式ROI，用长轴背景扣除法、短轴半径+长轴背景设置、短轴背景扣除法校正背景后，IntDen计算值分别为48629、10127、42589；

      2）长轴ROI模式按照自身Plot分布形态设计的背景扣除设置方案，所得数据明显大于短轴模式ROI测试值和在长轴ROI上用短轴ROI分析模式背景扣除方案的结果；

      3）长轴分析模式ROI，采用跟短轴分析模式完全一致的背景扣除设置，软件计算结果完全等效于短轴分析模式所得结果。

2.6  验证结论

       基于条带短轴信号分布创建分析选区ROI、计算ROI匹配的背景扣除滚球半径，运用于实例的检验测试说明：

       1）测试图像经90°旋转处理，未对ROI分析值产生明显影响；

       2）分别依照条带短轴和长轴模式创建的ROI分析数据差异明显，无可比性；

       3）按照短轴模式设计的ROI背景扣除设置，可以移植到长轴模式ROI。

       结果表明，原始图像旋转90°后，在条带短轴模式下摸索出背景扣除设置方案，可直接照搬用于常规长轴模式下创建的ROI分析。

三、讨论

      无论是实验技术网络论坛，还是期刊论文，在对Western Blot实验图像中条带背景扣除方法技术细节上，大家一直惜墨如金。究其原因可能有很多：

       1）或许是因为有Bio-Rad Quantity One或Image Lab Software，GE ImageQuant TL，AlphaView Software和UVP LS Software等专业凝胶图像分析软件的加持，软件内置背景扣除功能破解了数据分析中这道难题且屡试不爽，背景对这部分实验人员不算事；

       2）或许是Subtract Background这个环节太easy了，细节处理好坏，并不影响实验组间数据的显著差异，因而不屑一顾，故也就不足挂齿；

       3）背景扣除操作规则还缺少明文公约，操作过程主观性极强，一言难尽。担心过多讨论冲淡主题，甚至引发对数据分析结论准确性的质疑。

       针对Western Blot图像定量分析中背景校正环节滚球半径的准确理解运用的困境，我们基于ImageJ软件和反复实测基础上，提出Rolling Ball半径应基于具体条带的强度信号沿短轴信号分布范围的设计放法，借助于ImageJ的Plot profile分析模块，以条带强度值分布形态为基础创建ROI，并据此确定Rolling Ball半径。

      本文还进一步证实：基于短轴模式下创立的ROI条带背景扣除方案，可直接应用于常规长轴模式下建立的ROI分析。前提是，两种模式下建立的ROI位置、范围和大小完全相同，以确保被分析的图像像素完全一样。此前《在Western Blot条带定量分析中图像灰度值的应用实测》公开的数据，全部基于条带短轴分析模式产生。此验证测试结果，是对已发表结论的有力支持、完善和补充。这样的益处显而易见，有效避免了因担忧图像旋转处理造成的图像信息损失并因此引发的争议与质疑。

      创建ROI后如何计算Rolling ball的半径值？请参考《Western Blot条带分析中如何计算ImageJ的滚球半径？》一文。

参考文献：

   1. 在Western Blot条带定量分析中图像灰度值的应用实测(上、下)

   2. Quantity One Version 4.4 User Guide（4000126-14，RevA）