为Western Blot条带分析背景扣除牛转乾坤的Rolling ball

让ImageJ在Western Blot图像分析中绽放-4

  《 如何用ImageJ为Western Blot条带定量建立分析选区》一文探讨用ImageJ软件的Plot Profile分析功能创建ROI的具体操作方法。接下来，要把Western Blot条带图像ROI转化成精准数据，要迈过难关就是如何有效实施ROI的背景扣除。
      本文聚焦ImageJ图像分析中Subtract Background所用的神器滚球Rolling ball，理解其校正图像背景的原理基础上，探讨在Western Blot条带定量分析中的如何有效运用这一神器的问题。
一、ImageJ中的rolling ball到底如何扣除背景？
      Rolling Ball,即Rolling disc，Rolling ball algorithm，Rolling ball background subtraction algorithm, rolling ball procedure,称为滚球算法，滚球背景扣除算法, 由Sternberg Stanley在《Biomedical image processing》（IEEE Computer, Jan 1983)中首先提出，至今仍是医学图像处理中校正图像背景或去除背景强度差异（remove background intensity variations）的著名程序工具。
      据网上公开的斯坦利·斯特恩伯格《Biomedical image processing》原文部分内容，Rolling ball algorithm理论模型如图1所示。

      把数字图像比作一幅3D地形图，则地形中的任一点，相当于一个像素，除具备X、Y经纬坐标，同时还有一定的海拔高度（相当于图像中像素强度）。 滚球算法理论，就是设想有一个圆球沿着3D图像的“地表”下地形起伏而滚动（rolled over the bottom side of this surface）。功效如同地铁修建用盾构机，滚球在滚动中，把表面可触及到地质成份通通凿去（the hull of the volume reachable by the ball is the background to be subtracted）。

      地形中某些像素聚集形成一定海拔高度的信号峰突出地表，而球体因直径限制而卡嵌在“峰”的两翼后，球体只接触到峰的底部一定高度范围。

       无论是峰内还是峰外，凡球体之所及，通通削除。去除背景后的3D地表形态，状如图2中的喀什特地貌图：一望无垠的平野，点缀着一座座千姿百态的孤峰。

       将整个三维地表来个扭转乾坤后，依然是一个高低起伏的3D地貌。

       倒立的山峰，此时形同大小深浅不同的坑。圆球直径过小的话，会直接掉入坑中。当圆球半径足够大，因坑口支撑，球体仅有部分陷于坑中。 球越大则陷得越浅。

       峰口处箭头所指为球-峰切点。切点间的圆弧线被视为是坑周围地形自然延伸（相当于图像的背景），不视为坑的有效容积，需予剔除。切点弧线以下橙色区域，才算作坑的有效容积（相当于图像信号峰的有效强度值）。

       圆球陷入坑口部分的深度，取决于两个关联因素：

1）坑的跨度

       跨度越大，要求球体直径相应也大，否则大半球体深陷甚至沉没于峰体中，造成峰切削过度；跨度小，则与之有效相切匹配的球体相应也小。

2）球体直径

       不同峰型，底部外形不一，跨度不同，与之匹配的圆球直径也不同。

       与Photoshop对图像调整仅局限于选区不同，滚球背景扣除算法中，圆球用逐行滚动方法扫描图像中每一个像素点。但凡暴露于”坑“外较平整处的像素，皆为球可触及之所，该像素信号值予以清除。滚球无法触及的像素，削去球体可达到部分信号后再被分析统计。由于每个选区通常包括数十行像素，软件会将相同Y坐标像素的像素按列为单位，将“残余”像素强度值平均后予以呈现和统计。

       滚球半径不同，滚球处理后，整幅图像所得的像素强度也不同。对不不同的“坑”（信号峰），采用不同的滚球半径处理，背景扣除后的统计值存在区别。

       实测也表明，同一个图像副本，相同ROI设置，采用软件默认的50像素滚球半径设置，最后的分析值与实测中优化的半径值差距可谓天然之别。以《在Western Blot条带定量分析中图像灰度值的应用实测-上》中所用的条带1、5为例，采用实测优化滚球半径的分析值分别为17799、3557，而采用50个像素滚球半径的分析值为20991、6502。经两种半径处理后，条带1和5的比值0.200 VS 0.310。分析结果彻底偏离了实验中条带蛋白原始含量的对比关系。

      不同条带，由于条带强度信号分布的差异，导致峰型各异，与之匹配的背景扣除滚球半径值，必然有所区别。这正是前文《实测》所提及的一（条）带一（背）景的的理论依据。

二、对ImageJ指南中rolling ball半径设定方法描述的解读
      关于图像背景扣除用滚球半径设定，ImageJ指南做了如下说明：
      【As a rule of thumb, for 8–bit or RGB images it should be at least as large as the radius of the largest object in the image that is not part of the background. Larger values will also work unless the background of the image is too uneven. 】
      根据经验，对于8位或RGB图像，滚球半径应该不低于图像中最大分析目标的外形半径。在图像背景较均匀的情况下，设定半径大于分析目标尺寸半径亦可。但如果图像背景太不均匀，半径大并不好。
      【For 16-bit and 32-bit images with pixel value ranges different from 0～255, the radius should be inversely proportional to the pixel value range (e.g., for 16-bit images，pixel values 0～65535, typical values of the radius are around 0.2 to 5).】
      对于16位和32位图像，圆球半径应与像素值范围成反比。例如 16位图像，像素灰度值范围为0～65535，圆球半径通常为0.2～5像素）。
      ImageJ指南中，采用8-bit黑白灰图像做示例很普遍，但却没有如16位和32位图像那样，提供8-bit图像圆球半径的参考“经验值”。但却很容易让人误以为8位图像应该也有一个跟像素值成比例的半径值。刚好，这段描述文字下引用了一幅图用于演示图像背景扣除前后背景变化的效果（见图4）。 

       图中的subtraction background设置面板窗口中，有个50.0 pixels的Rolling ball radius。
      作为指南，原本应该对图片的处、50像素半径值的设置理由有个简单的标注，却只字未提。
      如果不加分析的话，可能部分人也会认为：8位图像的滚球半径可能也与像素值成比例，该半径值可能也类似于0.2～5像素那样是一个很小范围。而正是这样一种预期心理，加上50像素大于16位图像的5个像素。于是，这个来路不明的50像素半径值，就这样稀里糊涂地成为了ImageJ爱好者眼中的网红。在某乎发表的教程中，就采用了这个备受瞩目的50像素作为Western Blot条带定量分析中扣除背景滚球的半径值。
      目前，基于我们自身的大量实测经验，可以认为，Western Blot条带定量分析中，不结合图像具体情况，动辄采用网红半径值的，大半都是错误的。
      对ImageJ软件指南中这段话寥寥数十个单词应该这样来解读是合理的：
      1）不同的8-bit图像，如图像背景平滑而连续（譬如电泳凝胶图像等），则滚球半径大于等于被分析对象的半径。这个radius，可以理解为这个分析对象的几何尺寸、半径等，不能简单理解为这圆型的分析对象。
      2）正如《如何用ImageJ为Western Blot条带定量建立分析选区》建议的那样，分析选区划定的重要原则就要是尽最大可能把被分析对象所属全部像素收入ROI，同时尽可能地把属于图像背景的像素从分析选区中排除出去。了解这一规则后，“the largest object in the image that is not part of the background”可理解为，在不包含图像背景的前提下被分析对象所能覆盖的最大范围。
      3）被分析对象类型不同，则其所能覆盖的范围、自身规格尺度会有差别，而对应的滚球半径也应存在区别。不同实验类型，如荧光标记的细胞样品，核酸蛋白的凝胶电泳，Western Blot实验、菌体克隆计数，免疫组化病理切片等，获取的实验图像区别很大。被分析对象，如菌体、WB条带、发射荧光的细胞，染色的组织团块等，在图像上形成的斑点、区域的形态和图像分布范围各异，使得图像处理用相应滚球半径必有差异。换句话说，实验者应根据不同样品、分析对象图像特殊性来决定图像背景扣除用的最佳滚球半径，而非一个50像素应用于所有类型图像分析。
      4）同一个对象置，背景如果保持均匀，半径略加大还可以。但若背景很不均衡、不连续，则增大滚球半径，是无效的。
就是说，即便分析对象一致，如图像所处的背景条件不一致，则对应的滚球半径很可能不同。这暗示，滚球半径值除了受分析对象尺寸范围大小的限制，还受分析区域所处图像背景情况制约。图像背景不均衡不均匀的情况下，滚球半径设定尺度会有变化。

三、Rolling ball合理设置对改进Western Blot条带定量分析数据质量具有重要意义
      ImageJ软件图像背景扣除的采用的算法，一个是经典Rolling Ball另一个就是平滑抛物线算法（Sliding Paraboloid Algorithm）。但抛物线顶点曲率半径还沿用的是滚球的半径（a paraboloid that has the same curvature at the apex as a ball of that radius）。因此，无论经典Rolling Ball还是更精细sliding paraboloid算法进行背景的扣除，滚球半径值才是核心和关键。
      ImageJ软件自投入应用数十年来，被分析过的图像和类型多得难以计数。然而，官方在历次用户指南更新中，不同类型图像所适用的滚球半径值参考方案，从未发布。退一步说，授人以鱼不如授人以渔。那怕总结出一套天下英豪应用过程中对不同实验图像的滚球半径设定范例，也足以让初学者受益匪浅。可惜，这个事情，即便是NIH，也难以满足芸芸众生的热切期待。
      在Western Blot实验图像分析中，扣除ROI背景的滚球半径的设置，到底参考什么radius或size，无论是ImageJ、UVP和Bio-Rad的软件指南中，均无明确可供参考意见。
      事实上，背景扣除滚球半径值的设置，对Western Blot图像分条带定量分析结果的影响巨大。滚球半径设定不当，轻则有损实验数据的准确性与可靠性，重则使实验结果评估引入歧途。
      半径越小，获得的有效信号中的背景“水份”越小。不合理地缩小滚球半径后，强信号条带检测值损失极为明显。UVP在软件操作指南也提到，过小滚球半径会因“滚进”条带内部而大量消除有效信号数据（An excessively small disc will "roll into" bands, eliminating the band data almost entirely）。
      随着滚球半径加大，各条带检测值均由小渐大。弱信号条带和强背景干扰条带检测值飙升，说明对扣除背景的作用弱化。当半径超过一定范围，球体弧线由于太“平直”无法与测试曲线相切，彻底丧失去背景的作用。这一点ImageJ和UVP软件指南的结论是一致的。这也验证了《在Western Blot条带定量分析中图像灰度值的应用实测-上》采用的“一带一景”策略的必要性。

四、结语
      ImageJ指南虽然关于图像背景扣除中滚球半径设置方法缺少必要说明。但是半径设置的整体原则是要要求的，即：视不同分析对象而定，依图像背景情况而定，半径值相当于被分析对象在图像上的最大尺寸范围。
      而Western Blot图像条带分析实测经验，同一Blot中，不同条带因外形和周围背景条件有别，宜采用不同优化半径。 而不同批次的Western Blot图像，因凝胶电泳和印迹杂交操作过程存在差异，即便采用同一个成像系统和完全相同成像曝光设置，背景扣除滚球半径也是一“径”难求。
      电泳凝胶和Western Blot图像条带定量分析中，扣除背景滚球半径的设定时，到底参考什么尺寸才符合分析要求？此话题将在《Western Blot条带分析中如何确定ImageJ滚球半径？》中讨论。

参考文献
      1. Bio-Rad Quantity One User Guide for Version 4.4
      2. Life Science Software Installation and User Instructions (81-0254-01 Rev L)
      3. ImageJ User Guide (IJ 1.46r)