生物医学样品微量紫外光度测定的技术原理和方法-上

       分子生物学实验样品用量少，核酸蛋白提取的产量有限。不要说标准石英比色皿（Cuvettes）最低测试样品体积（Min. Volume）0.5mL、半微量比色皿（Semi-Microcell）动辄0.10 - 0.25mL，即便是50 μL微量比色皿（Microcell），上样体积也达到50 μL。对于常规10-25μL的PCR反应体系，这样的核酸样品耗费，显然太过豪奢。撇开标准10mm光程最高检测浓度上限较低不谈，对低丰度样品稀释至50 μL后，很可能超出标准10mm光程紫外吸光度最佳测试范围，测试准确性难以保障。因此，核酸蛋白测定体积的微量化成为分子生物实验的时代刚需。

       纵观国内外众多微量紫外可见光度计产品的技术特点，不难发现，在探索和实现样品紫外微量化测定的风尘中，依稀可见5个用自己方式追逐梦想的身影。

一、Eppendorf BioPhotometer生物分光光度计

       1998年，随着PCR实验日渐普及和实时荧光定量PCR商业化应用，Eppendorf将从常规综合型紫外可见分光光度计中的核酸、蛋白及细胞测定等有关功能方法加以整合，率先推出了BioPhotometer生物分光光度计。                                              

       BioPhotometer对核酸蛋白按测定任务分门别类予以细化、模块化，并在仪器控制面板设置专门功能键。譬如核酸测定工作，面板上设置了dsDNA、ssDNA、RNA、Oligo四个快捷功能按键。蛋白测定直接细分为Protein 280nm、Bradford、BCA、Lowry法。实现了测定任务的一键直达。
        不仅如此，系统已预置了每项应用程序的测试参数和条件，无需常规紫外应用软件复杂层叠菜单操作和设置，使得测试数据规范化，减少人为设置失误。如双链DNA样品测定，系统自动完成A260 nm以及额外的A230, A280和A340 nm共4个吸光度指标测定报告，同时自动显示样品浓度测定结果以及A260/280、A260/A230两项核酸纯度比值。
       BioPhotometer生物分光光度计的创造性设计，真不愧是同类仪器的开发者、实验研究人员的“导师”。

      Eppendorf在生物样品测定技术领域的另一个创新，是开发出测试波长范围220 -1600nm的紫外可见通用型双光程UVette比色皿。

       按照朗珀-比尔(Lambert-Beer)定律基本原理：同种物质样品溶液，浓度越高，Ia值越大；相同浓度样品，测试光程b越大，Ia值越大；压缩测试光程，Ia值减少。

       UVette为精巧的漏斗造型设计：底部为长10mm×宽2mm×高2mm的狭长形微量样品槽（容积50μL），中部为漏斗部（总容积500μL），上部为正常比色皿形状（总容积1mL）。

       采用两种光程设计，既可以沿着底部狭槽的10mm的长轴方向检测，也可以将UVette旋转90°使光束沿着2 mm短轴方向检测。其优势在于：普通浓度范围的样品使用10 mm光程测定；高浓度样品，用2mm短光程检测，通过软件算法自动归一化处理转换为10mm测试值。

       实测中，约200mg临床肥胖症患者来源的脂肪组织提取总RNA（产量20-60μg），分别溶于30-50μL 含DEPC去离子水中制成原液。取1μL RNA原液用DEPC水按1:75比例稀释后，移入Uvette，在Biophotometer分光光度计上进行A260测定。实时荧光定量PCR反应结果表明，UVette微量比色皿测定性能满足qPCR实验的总RNA样品测定量要求。

二、日立UH5300紫外可见分光光度计

       标准光程比色皿，底面为10mm×10mm正方形，测试光束从比色皿正面距离底面8.5mm高度的中心位置垂直入射，光束中轴位置对应的样品体积为0.85μL，样品体积须大于此容积方可进行正常检测。由于液面存在一定弧度的向下凹陷，为确保液面中心（最低处）位置高于测试光束，故实际测试样品体积不少于1mL。

       要减少样品体积，只能以测试光束在比色皿后壁的出射点为中心，X、Y、Z三个方向上同时缩减液体所占空间。

       测算表明，2mm宽×2 mm深×1 mm厚的液样，容积为4μL。只有当测试光束形成横切面直径1.0mm的圆形光斑或边长1.0mm×1.0mm正方形（对角线为1.44mm），才能实现最低1.5μL样品完整包绕测试光束。

       世上无难事，只怕有心人。

       日立公司2013年上市的UH5300，就提供了一款痕量样品池(trace sample cell)。该样品池的光程仅1mm，可用于1.5 - 4μL样品的测定。

       资料显示，UH5300微量比色皿解决方案具有代表性：垫高微量检测池架的位置，样品溶液层厚度压缩到1mm（压缩了光程，可通过软件算法校正为标准10mm光程的校正值）。

       考虑到加工难度和移液器加样的可行性，1.5μL液量很可能已是这类比色皿款式样品池容积的下限。

       该检测池须与池架底座(holder base，用于垫高检测池架，使池内液体的中心抬高与测试光束的中轴重合)、检测池架 (single cell holder,比色皿架)和比色皿遮光罩(cell mask)一起使用。除非UH5300主要用于生物学微量样品的测定，否则微量测定模块与其他常量应用测试模块的更换，要耗费功夫。

       此外，每个样品测试前，样品池都需经自来水冲洗、去离子水冲洗、甩干或风干后使用，操作之繁琐，不言而喻。

三、AlphaSpec μL微量分光光度

       0.5-2.5μL量程移液器被常用于PCR实验中模板、引物的精密移取操作。

或许受此启发，原美国Alpha Innotech公司于2008年开发出了AlphaSpec μL微量紫外可见光度计（已停产）。它不用比色杯、毛细管，也无需将样品滴加到检测器表面。关键在AlphaSpec采用透射紫外的聚合物材料、结构特殊设计的AlphaUV移液吸头。

       这种吸头上部与吉尔森P10移液器吸头完全一致，但接触样品的底部为类似USB接口的长方体扁管（内腔厚度1mm，相当于1mm光程，有效容积2.5μL）。液体控制与常规移液器操作完全一致。

       检测光束可以垂直穿透吸头薄壁检测样品。操作时，移液器装上AlphaUV吸头后插如特制的检测器接口，2秒钟测试完成后，取下移液器并更换一新吸头，可立即进行下一个样品测定。无须清洁测试端口样品残留，操作简便、高效。因此，特别AlphaSpec适合于样品量极其有限，希望完成测试后可以回收样品的研究工作。

 （待续）