蛋白提取纯化的几种常用方法

蛋白质的分离纯化在生物化学研究应用中使用广泛，是一项重要的操作技术。

蛋白提取包括总蛋白提取、总膜蛋白提取、胞浆蛋白提取、细胞核蛋白提取等，分离的蛋白不仅可以用于研究蛋白在细胞内的定位，还可以用于下游的功能研究，比如转录调控、信号转导、酶活分析等。

不同的蛋白质在它们的许多物理、化学和生物学性质有着极大的不同，这些性质是由于蛋白质的氨基酸的序列和数目不同造成的，连接在多肽主链上氨基酸残基可是荷正电的、荷负电的、极性的或非极性的、亲水的或疏水的，此外多肽可折叠成非常确定的二级结构（α螺旋、β折叠和各种转角）、三级结构和四级结构，形成独特的大小、形状和残基在蛋白质表面的分布状况，利用待分离的蛋白质与其他蛋白质之间在性质的差异，即能设计出一组合理的分级分离步骤。

 一、超速离心法

超速离心分离法用于分离亚细胞成分和蛋白质，是进一步纯化的第一次过筛。此法分离和纯化抗原的原理是利用各颗粒在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的颗粒处于不同密度梯度层内，达到彼此分离的目的。常用的密度梯度介质有蔗糖、甘油、CsCl等。Beckman Avanti J-26S XPI、赛默飞Multifuge X4R Pro、eppendorf 5810R、日立CR-22N等立式低温高速大容量离心机，赛默飞Multifuge X1R、eppendorf 5804R等多功能高速离心机、Heraeus Fresco 17 Fresco 21、eppendorf 5424R等微量高速离心机离心机均可满足这个功能需求。

二、选择性沉淀法

 选择性沉淀是采用各种沉淀剂或改变某些条件促使抗原成分沉淀，从而达到纯化的目的。

 1、盐析沉淀法

这是最古老而又经典的蛋白质纯化分离动技术。由于方法简便、有效、不损害抗原活性等优点，至今仍被广泛应用。蛋白质在水溶液中的溶解度取决于蛋白质分子表面离子周围的水分子数目，亦即主要是由蛋白质分子外周亲水基团与水形成水化膜的程度以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。由于各种蛋白质在不同盐浓度中的溶解度不同，不同饱和度的盐溶液沉淀的蛋白质不同，从而使之从其他蛋白分离出来。常用的盐溶液是33%～50%饱和度的硫酸铵。

盐析法简单方便

（1）抗原的粗筛：用不同饱和度的硫酸铵或硫酸钠可将一个复杂的组织液吩成若干组分，也可收集某一饱和度的盐析沉淀物作为进一步纯化的粗筛物。最常用的盐析剂是33%～50%饱和度的硫酸铵。

（2）提取丙种球蛋白：丙种球蛋白主要为IgG（95%以上）。将35%～40%饱和度的硫酸铵沉淀物经去盐后可直接用于某些试验作为抗体试剂。此法简单、稳定、固收率高，已成为免疫化学试验的常规方法。

（3）抗原的浓缩：在液体中含量较少的抗原，如尿中的游离轻链及离子交换层析洗脱液中的抗原，可通过加入硫酸铵，将其沉淀下来，以利进一步纯化。

盐析法提纯的抗原纯度不高，只适用初步纯化。

影响盐析的因素有：

（a）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。

（b）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶解度最低。

（c）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。

蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。 其中应用最多的硫酸铵；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。

蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。

 2、有机溶剂沉淀法

有机溶剂以降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度降低。有机溶剂与水作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中被沉淀析出。使用的有机溶剂多为乙醇和丙酮。

高浓度的有机溶剂易引起蛋白质变性、失活、操作必须在低温下进行。

一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的脂蛋白提取液。但必须在低温下操作。

丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。

另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。

将有机溶液例如丙酮和乙醇加入蛋白质溶液时，和高浓度盐类似产生沉淀，这是因为它们能够降低蛋白质的溶解度。

在温度为 10 ℃ 左右时蛋白质在有机溶剂中容易变性，所以在沉淀时必须特别注意冷却溶液和离心转头（0 ℃～4 ℃ 为佳），建议离子强度为 0.05～0.2 mol/L。

注意：

1 酸性蛋白质在二价阳离子例如 Mg2＋ 存在下，以复合物的形式较易被沉淀。

2. 大分子的蛋白质及亲水的蛋白往往在较低浓度的有机溶剂中就能析出。

3. 在溶液 pH 值接近蛋白质的等电点时，蛋白质在有机溶液中的溶解度降低。

 3、水溶性非离子型聚合物沉淀法

水溶性聚合物常用的聚合物为聚乙二醇（PEG）及硫酸葡聚糖，其沉淀蛋白质的机制尚不清楚，大致有如下解释：

（1）聚合物与蛋白质形成共沉物；聚合物与蛋白质之间发生水的重分配；

（2）聚合物与蛋白质形成复合物。此法受许多因素影响，主要是pH、离子强度、蛋白质浓度和PEG的分子量等。分子量为2000～6000的PEG皆适宜于做蛋白沉淀用。

三、凝胶层析法

凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。

凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。

凝胶是具有三维空间多孔网状结构的物质，样品溶液缓慢地流经凝胶层析柱时，大分子物质不易进入凝胶颗粒的微孔，只能分布于颗粒之间，因此在洗脱时向下移动的速度较快，先被洗脱。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，洗脱时向下移动的速度较慢，随后被洗脱。因此，蛋白质分子按分子大小被分离。

 四、离子交换层析法

离子交换层析的原理是利用一些带离子基团的纤维素或凝胶，吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原。由于各种蛋白质的等电点不同，所带的电荷量不同，与纤维素（或凝胶）结合的能力有差别。当梯度洗脱时，逐步增加流动相的离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争纤维素上的电荷位置，从而使吸附的蛋白与离子交换剂解离。

在离子交换色谱技术中常用的离子交换剂有以下几种

①具有离子交换基团的纤维素，如羧甲基（CM）纤维素、DEAE-纤维素

②具有离子交换基团的交联葡聚糖、琼脂糖和聚丙烯酰胺

③凝胶合成的高度交联树脂。

 五、亲和层析

亲和层析是利用生物大分子的生物特异性，即生物大分子间所具有专一亲和力而设计的层析技术。

例如抗原和抗体、酶和酶抑制剂（或配体）、酶蛋白和辅酶、激素和受体、IgG和葡萄球菌蛋白A（SPA）等物质间具有一种特殊的亲和力。

例如提纯IgG时，可将SPA吸附在一个惰性的固相基质（如Speharose 2B、4B、6B等）上，并制备成层析柱。当样品流经层析柱时，待分离的IgG可与SPA发生特异性结合，其余成分不能与之结合。将层析柱充分洗脱后，改变洗脱液的离子强度或pH值，IgG与固相基质上的SPA解离，收集洗脱液便可得到欲纯化的IgG。

 亲和层析法纯化蛋白质抗原的主要优点是纯度高，简单快捷，但成本较贵。

以上是蛋白提取纯化的几种常用方法，最后附上几种蛋白层析的方法的对比