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APC相衬技术在细胞显微成像中运用的技术原理及启示——上
自Frits Zernike发明相衬显微观察技术以来，基于惠更斯—菲涅耳原理用函数方法验证和推导其成像机制的研究繁多，但以问题为导向，从微观视角探究困扰细胞相差成像中的伪影等图像亮度分布失衡现象产生的必然性并提出系统性解决方案的，则少之又少。这种现状的存在，分析起来可能是这个几个因素造成的。
一是硬件上，相衬技术几乎离不开相差物镜，而相差物镜难免会降低荧光成像质量。改进相差图像品质的努力前景不佳。二横向对比看，同样是采用透射光光路，用DIC、霍夫曼观察法所获得的图像，无论是图像对比度、细胞内部结构细节表现力均优于相差法，且厚薄样品通吃，明场物镜、荧光物镜均适用，足以替代相差技术。第三是科研考评价值上，经典技术方法体系的二次开发与再认识的技术前瞻性、研究成果学术影响力可能不够。这种顾虑影响了人们以此选题攻关的积极性。所以，尽管发现相差图像伪影问题由来已久，但探索解决问题的实践和成果产出屈指可数。
早在2005年，Leica将新型内置相衬技术(Intermediate Phase Contrast, IPH) 引入到DMI3000B倒置显微镜上。IPH是将相差物镜内置相位板移出，做成与环形光阑滑块类似的独立相衬模块（Phase Contrast module），在物镜与目镜间传输光路的中间出瞳界面（Intermediate pupil interface）设置前置模块（Front Module）作为相位板滑块安装插槽，达到了对透射光相衬调制目的，且便于根据观察需要即插即拔。最关键的是，IPH方法实现了物镜与相位板的分离，配置普通平场荧光物镜不仅获得对比度极佳的相差图像，更契合对高品质荧光成像的需求。
虽然IPH相衬技术解决了相差物镜对荧光图像质量潜在影响问题，但图像伪影困扰问题依旧。
传统相差显微镜采集的细胞相差图像中最常见的伪影效应是光晕，是指围绕在细胞与细胞器外缘亮度极高的光环。它掩盖细胞边缘轮廓和细胞内部结构细节，干扰对镜下细胞形态和细胞功能状态的观察与分析。
在经典相衬技术诞生前，人们迫切需要找到一种能将透明相位体看起来更暗的技术方法。而有加工质量缺陷的衍射光栅的衍射光谱中所出现的黑色罗兰鬼线（Rowland ghosts），激发了科学家将细胞与光栅表明的瑕疵位点联系起来，用光波干涉产生暗条纹的原理让细胞原形毕露的灵感。当然，细胞比机器加工失误所致光栅局部外形要复杂得多。透射光与细胞样品相互作用时，产生直射光、折射光、衍射光及杂散光。镜下的细胞图像是多种光波相互叠加的综合结果，非光波干涉单一机制所决定。
迄今为止，对光晕的产生机制可能有多种解释。如折射率不同晶体间接触界面的贝克线理论（限于篇幅在此不作讨论）、衍射与直射光窜扰污染原理及角度依赖性圆孔衍射原理等。
一、细胞相差成像中的光窜扰污染
早在Frits Zernike创建相衬显微技术的过程中就已发现，如直射光亮度远高于衍射光，则镜下视野背景亮度过高，掩盖光波干涉产生的暗条纹图案，则无法进行相衬观察。当直射参考光的亮度削减至入射前的1/9时，其亮度与衍射光亮接近，相干叠加后图像对比度较为理想。
实验观察的细胞样品中，培养基液面深度通常都大于细胞和细胞团块厚度。细胞和培养基的折射率约为1.33-1.38，无论是透射光或衍射光，穿透液面时，因折射造成出射界面位点偏移入射方向而出现透射光传播方向的偏移。而偏移程度与样品层的折射率、样品层厚度相关。发自环形光阑经透镜聚焦形成的X型倾斜光，叠加折射所致光路偏移后，光传播方向更分散、不规则和难以有效约束[1] 。因此，倒置相差显微镜下所谓的“直射光”，尽管透射光束主体走向比较集中，大部分光将从相位板共轭区经过，但必有少量“直射光”因传播方向偏移较大，逃离共轭光环区而进入相位板补充区。
因此，有一种比较流行的说法是，光晕是因样品中衍射光和直射衍射光在相位板的共轭区与补偿区结合部窜扰污染所致。
当逃逸的“直射光”从相位板补偿区无损穿过时，其振幅与相位均无变化，镜下视野的背景亮度上升，使得直射参考光（即Direct Light，下同）与衍射光（Diffracted light）相干叠加图像中明亮条纹亮度进一步增加、面积扩大，而灰暗条纹色泽变浅。最终结果是图像的亮度分布失衡加剧，对比度下降。而削弱穿透相位板补偿区的“直射光”光量，则可降低图像整体亮度和光晕条带扩大化污染效应，有利于提升图像对比度。
另一方面，若原本存在相位后延1/4波长的衍射光“误入”共轭区，则这部分衍射光的相位会被提前1/4波长后，相当于用少量照明光经共轭区给图像补光。而正常通行的直射参考光的相位因相位环调制而提前1/4波长。理论上，错位衍射光与直射参考光因存在1/4波长相位差而发生相干叠，造成图像局部参考光振幅减弱后，镜下视野灰暗条纹振幅削弱，同样有损暗条纹图像的暗色。但因其光量少，对图像整体亮度分布干扰作用远不如“直射光”串扰效应显著。
由此可见，直射光因亮度高，其窜扰污染对相衬图像对比影响更大。而要降低图像亮度，削弱光晕、增强图像对比度，对直射光窜扰污染的治理是关键。
二、相位体尺寸依赖性夫琅禾费衍射条纹分布原理
2.1 由夫琅禾费衍射（Fraunhofer Diffraction）原理得出的推论
有道是：物理的尽头是数学。早就有先贤数学语言对波动光学中的衍射条纹分布规律做了淋漓尽致地表述。
假设两列传播方向分别为A1P、A1P的子波，在P点相遇。子波从A1、A2到P点的光程r1、r2和波长决定了两列子波此时各自的相位：
φ1 = 2π•r1 /λ , φ2 = 2π•r2 /λ ••••••••••••••••••••••••••••••（1）
P点的相位差Δφ为：
△φ = 2π•（r1 – r2）/λ ••••••••••••••••••••••••••••••（2）
根据惠更斯－菲涅耳原理（Huygens–Fresnel principle），从同一波阵面上发出的子波经A1、A2，在P点相遇并发生干涉时，叠加波复合振幅A的大小由二者在P点的相位差决定。A与△φ之间的联系可用以下公式表示:
A2 = A12 + A22 + 2A1•A2•cos(φ1 -φ2) ••••••••••••••••••••••••••••••（3）
当在P点的相位差φ1 -φ2为子波的1/2波长时，将发生相消干涉，复合振幅A最小，P点为暗斑。
当r1 – r2 =±Kλ（K=0,1,2,3，……）时，△φ=φ1 -φ2=π，复合振幅A最大，P点为量斑。
因透射传播方向的无序性，衍射-直射光参考随P点位置改变而相位差具有多样性，故在像平面相干叠加形成的是明暗交织的图像。
在经典夫琅禾费衍射（Fraunhofer Diffraction）过程中，来自无限远处平行光（如倒置相差显微镜中，安装在透镜焦点上的点光源在透镜像方产生的平行光）通过光学圆孔（或光学狭缝，为方便表述，统一圆孔为例），并经透镜聚焦后可在像屏上形成明暗相间的同心圆环图案。图案中央为衍射圆斑（艾里斑，Airy Disk），亮度最高。中心亮斑往外，为暗环-明环-暗环的交替分布。
圆孔衍射中的圆孔直径a、衍射角θ、衍射光波长λ之间的关系可表示为：
Sinθ = ±λ/a ••••••••••••••••••••••••••••••（4）
单色光发生圆孔衍射时，圆孔直径大，则衍射角小。圆孔小，则光衍射角大。
衍射像面上相邻两个调明暗条纹中心的距离用△x表示。△x随衍射角和物镜焦距的增加而加大。
当θ较小时，sinθ ≈ θ，故为方便计算，中心暗斑（P0级暗斑）和相邻的第一级亮环(称为P1级亮环或P1级亮环）之间的△x、衍射角θ、圆孔直径a和物镜焦距f之间计算关系为：
△x = f•θ ••••••••••••••••••••••••••••••（5）
此外，还可将△x与衍射光波长、圆孔直径a、物镜焦距f之间计算关系表述为：
△x = f•λ/a ••••••••••••••••••••••••••••••（6）
可见，是照明光波长λ、衍射角θ、衍射圆孔直径a和物镜焦距f这四个因素的共同作用，决定了圆孔衍射图像的布局。而其中，照明光波长λ、衍射角θ发挥着关键调控作用。
实际上，所有衍射条纹，是由衍射角在0＜θ＜90范围衍射光形成的多个宽窄不同的小衍射条纹相互重叠组合而成的。只是因不同单色光衍射条纹距离太近，肉眼可感知到的并非彩虹布局的条纹，而是由多色小条纹叠加形成的白色复合大条纹（将衍射像屏移到足够远的距离，衍射条纹图像放大尺度足够后，即可观察到内向外、波长由短至长、排列有序的彩色条纹图案）。
白光中的红黄绿光波长长，蓝紫色光波长较短。据公式（4）可知，当圆孔直径相同时，红黄绿光衍射角大，蓝紫光衍射角小。在同一个条纹中，红黄绿光的衍射小条纹距离P0点比短波长蓝紫色条纹要远。而小角度蓝紫衍射光的条纹分布位置靠近中心点P0，具有向心分布的特点。因此，衍射条纹中波长、衍射角度光线组成的变化，会使亮色大复合条纹的几何宽度及条纹亮度中心位置发生向心或离心方向的偏移。
光的波长长，则亮衍射条纹角半径大，条纹变得粗大，亮度比较分散，与相邻条纹中心的间距大。而波长短，则衍射条纹细，条纹光能量分布集中，相邻条纹间距缩小，从而对暗条纹分布空间挤占更明显，使得暗条纹变窄。故白光衍射条纹宽度大于由红黄绿等单色光形成的衍射条纹宽度，且相邻明暗条纹间隔更小、界限更模糊。
而公式（6）则表明，相同衍射波长条件下，大圆孔衍射产生的条纹窄，光亮度分布集中，相邻条纹，特别是明暗条纹间间距小，亮纹对暗纹分布干扰大。小圆孔衍射的条纹宽度大、条纹中心的间距大，光亮度集中程度降低，明暗条纹间的界限相对清晰，明纹对暗纹侵蚀干扰小。
2.2 用夫琅禾费衍射原理对细胞相差观察法光晕现象的分析
组织细胞、iPS细胞团块、3D细胞球、类器官等透明样品皆为微米尺度的相位体，在透射光照射会发生360°全方位衍射。故采用无限远光学系统的倒置相差显微镜生成相衬图像，可用夫琅禾费圆孔或狭缝衍射原理来解释[3] 。
经典琅禾费衍射重点关注的是相干波因光程差异所致的相位差和图像亮纹的分布。而倒置相差显微镜中，直射参考光、衍射光在离开相位板时就已存在1/2波长的初始相位差。因此，在相差观察模式下的衍射模型图中，P0并非大亮斑而是尺寸大小与明环接近的暗斑，P1级圆环则是最亮、最宽的明环。从原理上讲，相位板后光路衍射图与经典夫琅禾费衍射图是互为反相、黑白对调关系。
将细胞及类器官等细胞团视为大直径衍射圆孔，则细胞器等可看作小直径圆孔。因此，高倍镜下的细胞相差图像，其实是大圆孔内套小圆孔两种尺寸衍射条纹叠加的结果。与经典琅禾费衍射观察重心不同，细胞图像关注重点，并非图案中的明环，而恰恰正是图案中心P0级暗斑。
细胞或细胞团的直径大，P0级衍射暗斑直径本来就小，而紧紧环绕其周围的是P1级明环。从图像上看，几乎所有细胞外缘都被亮色光环笼罩。这是因为P1级圆环光亮度极高而分布集中，与中心暗斑间距小，P1对P0“补光”，造成亮环侵蚀暗斑严重，掩盖了暗斑外缘灰暗轮廓。
光晕并不局限于细胞外缘，同样还环绕在亚细胞器周围。在高倍镜下可见白光冲斥细胞器间隙。只是小圆孔衍射中的P1级明环面积大而亮度较低，且与P0中心暗斑相距较远,所以镜下还可以大致辨清细胞器分布位置。
细胞外围的光晕遮掩了细胞外缘轮廓，干扰了对细胞团的准确分割、细胞的计数和细胞形态测量分析。而细胞器外围的光晕造成细胞器结构和界限难以辨识。
衍射图案中明暗条纹的宽度（即光斑直径或圆环宽度）、间距和亮度，是由圆孔直径和入射光条件决定的。因衍射圆孔直径无法选择，要克服光晕的不利影响，只能对照明光亮度、入射波长和衍射光衍射角进行调整。
1）适度削弱透射光强度，如引入透射光中性密度滤光片（即ND滤光片，可参考《细胞图像采集中倒置显微镜的透射滤光片合理使用》）下调视野整体亮度，从而降低P1级明环光量，一定程度上有助于减轻光晕。
2）配置暖色调LED透射光源，降低光源色温。这样既增加了入射光的波长λ，又增大了光衍射角θ，有利于拉开条纹间距，减轻高亮度条带对相邻暗条纹的干扰。
3）当调整光源照明条件并不适用时，则调整相位板光衍射角度成为抑制光晕的必然途径。
无论大小圆孔衍射，复合光源照明下，P1级明环中短波长、小角度光衍射条带的近心偏移分布，是造成明暗环带靠近重叠的根源。剔除或削弱小角度衍射光而保留大角度衍射光，则暗斑与次级明环间距拉大，减少明暗干扰，还可使视野中心的亮度得到抑制。这或许正是Nikon公司开发的APC相差对比技术的工作原理及灵感之源。
