APC相衬技术在细胞显微成像中运用的技术原理及启示——下

(前续：APC相衬技术在细胞显微成像中运用的技术原理及启示——上)

三、APC相衬技术抑制细胞图像光晕的技术原理与优势

       APC，是Apodized Phase Contrast的缩写。Apodized一词源于Apod（译为无足或足部不发达的动物，无腹鳍或腹鳍不发达的鱼）。光学术语中，“脚”是指衍射极限成像系统光路中的旁瓣（side-lobes）或侧环（side-rings）光信号。Apodization是一种用于移除“脚”光学过滤技术，用于除去衍射图案边缘的外环部分。例如用小孔光阑，将艾里斑周围的衍射环滤除，使光斑中心部分通过小孔，以此来实现对光斑的“去脚化”。apodized、apodization都有切趾、变迹、衍射控制等涵义。尼康公司官方将APC命名为切趾相衬（相差）观察法。

       APC相差观察法中的“切趾”处理对象是衍射图像中央暗斑相邻的两个条纹。就细胞相差图像而言，是要切除围绕在P0暗斑周围的P1级明环。对干扰亮环切除用的是透射光中性滤光技术，其核心是专门开发的、同样安装与相差物镜出瞳面的新型APC专用相位板。

       与传统倒置相差显微镜所用经典相位板光学结构上的最大区别在于，APC相位板的共轭环内外（参考《传统倒置相差显微镜在细胞图像采集中的运用与技术局限性-下篇》）两侧分别增加了一大一小（灰色的B环和C环）具有50%减光效应的中性密度滤光片（Neutral Density Filter, ND）。

       从位置上看，共轭环主要接收的是直射参考光，而内外两个ND减光环则位于大、小尺寸圆孔衍射（分别与细胞、亚细胞结构衍射对应）过程中的小角度衍射光的通路上。

       细胞器等小圆孔衍射中，光衍射角整体偏大，小角度衍射光占比低。而细胞团块等对应的大圆孔衍射中，大角度衍射光少，小衍射角光占比高。因此，ND减光环对小角度衍射光量的削弱效能，对大圆孔衍射过程要显著高于小圆孔衍射过程。

       ND减光环组要针对的是小角度衍射光，大角度衍射光则得到较完整地保留并可以畅通无阻，而这将对衍射条纹分布格局产生积极影响。

       根据前面的推论可知，小角度衍射光衰减后有两个明显效应：一是图像整体亮度的降低，二是削弱P1级明环近心侧的亮度，使P1级明环的整体亮度中心外移，减轻与P0级暗斑外缘的重叠程度，为呈现P0暗斑的外围轮廓创造了有利条件。相对而言，考虑到细胞样品两种衍射圆孔尺寸差异悬殊及对应明暗条纹分布的差异，ND环减光技术的应用，对细胞内部线粒体、脂滴、肌动蛋白束和细胞核等亚细胞结构的形态细节呈现更为有利。

       优化波长照明条件，利用切跖相差工作模式，还实现了如小鼠和人类胚胎和卵母细胞等厚样品中的纤维结构以及细颗粒构造的直接观察。

       当然，从几何光学角度看，ND环减光还屏蔽了亮度极高的窜扰高直射光，降低图像背景亮度，有助于提高图像对比度。对比显示，ND减光环引入后的图像视野高光区亮度下调十分明显。

       在切跖相差观察中，调整透照光波长，可使细胞器图像的对比度发生变化，有助于对人类胚胎卵周间隙颗粒状结构和细胞体内的纤维结构的辨识。使用650 nm带通滤光片调制透射光采集的胚胎图像中，细胞内部颗粒对比度高于用450 nm带通滤光片调制照明下的颗粒对比度。这是因为衍射光波长增加，明暗条纹间距拉大，白光对暗斑的干扰降低的原因。

       倒置相差显微镜的APC相衬观察法与经典PH相衬观察法，采用相同的聚光镜环形光阑，但配套相差物镜不同。经典PH相差物镜用的是DM或DL系列的PHL、PH1、PH2、PH3物镜，而APC相衬法用ADM、ADL或ADH系列PHL - PH3相差物镜，包括10x、20x、40x、60x和100x共5种放大倍率。Nikon公司的基础型Eclipse TS2-FL倒置荧光/相差显微镜、Eclipse TS2R-FL标准型倒置显微镜及Eclipse Ti-FL系列研究级高级倒置荧光显微成像系统均支持APC观察法应用。

四、APC相衬技术在细胞显微成像中运用的启示

       APC相衬观察法与Leica 的IPH外置集成相差观察法，本质都是在Frits Zernike经典相衬观察法基础上的再创新应用，对增进倒置相差显微镜技术性能、推进行业进步具有重要意义。IPH技术开发成功，提高物镜对多种观察法的适应性。APC则克服经典相衬观察模式下图像中局部光亮过度集中造成光晕干扰，改善图像中细胞外缘形态的观察效果，更重要的是，无需荧光染色处理，即可实现对线粒体、脂滴颗粒、纤维结构等亚细胞结构、区室细节结构的直接观察，还可用于较厚样品的观察。因此，为提升传统相差显微镜应用效能、提升细胞图像采集质量开辟了一条新的途径。

       目前，业界对这一经典相衬显微观察技术的改进工作，无论是沿着细胞成像方向对细胞图像形成过程从原理上做更深入研究，还是对该成像方法所暴露问题针对性解决之道的探索尝试方面，做的还不够。

       徕卡IPH技术，是遵循经典技术原理，利用现代显微成像系统的无限远光学系统光路节点和接口多的优势，调整相位板在光路中的位置而开发的。而APC同样是在经典相衬技术原理范畴内，根据衍射-干涉过程各光学要素及作用规律的深入分析而实现了技术迭代改进。可见，即便是已趋成熟的细胞成像技术原理、方法同样有再认识、二次开发的价值和必要性。

       据报道，利用X射线显微镜所特有的对厚样品直接进行无损高分辨显微成像潜力，将经典相衬技术与X射线相衬显微成像结合而开发Zernikel X射线相衬显微成像装置，用于生物样品的显微成像可达到30nm的超高分辨率。而基于经典相衬图像的相位、振幅和像之间的函数关系，利用Cycle-GANs深度学习算法开发的虚拟相衬成像处理方法，可将普通光学明场显微镜获取的细胞明场图像转换成标准相衬图像，细胞结构细节具有极佳效果。而将图像AI算法与传统显微镜的结合，有望消除经典相差图像中的光晕现象，提升细胞相差图像信息对细胞结构功能分析的价值。

       并非只有STED、GSD、SIM、PALM和STORM这些带着“前沿、新兴、高精尖”标签的技术体系才值得跟跑和关注。

       培养细胞观察过程中常用的4x - 40x物镜相差物镜的相位环规格有PHL、PH1、PH2之分，使用不同倍率物镜时通常需检查和核对聚光镜环形光阑与相差物镜PH标示规格的一致性，并据此调整光路中环形光阑。Olympus公司CKX53倒置相差相位镜采用的集成相衬系统（integrated Phase Contrast, iPC)，是针对4x - 40x物镜物镜的相位环规格特点，而开发的通用型PH1环形光阑及相衬滑板CKX3-SLP。实现了在不同放大倍率物镜间切换观察而无需反复调整相衬光阑的简便化操作。这一应用模块的技术含金量并不高，但却实实在在提升了使用体验，已成为进口倒置相差显微镜行业的风向标。

       从Olympus开发的细胞3D成像反转对比技术（Inversion Contrast，IVC)，到蔡司新型激光扫描共聚焦显微镜应用的Airyscan技术，从日本横河（yokogawa）公司开发成功后在激光共聚焦扫描显微镜、高内涵成像分析系统广泛使用的双转盘共聚焦光学技术（即微透镜增强型双转盘扫描技术，Microlens-enhanced Nipkow Disk Scanning Technology），到美国PE公司开发用于Opera Phenix高内涵成像系统上可支持FRET、钙离子成像应用的Synchrony光学系统，莫不是以经典技术方法体系为基础，在痛点和难点牵引下，经锲而不舍努力后善作善成之杰作，实现技术性能的迭代和弯道超车。在技术问题上，无所谓新旧冷热，关键是取决于人们对特定技术方法体系的基础认知到底有多全、多深，是否有发现问题的眼光、正视并解决问题的决心与恒心。

       回到透射光细胞成像话题上来，IVC细胞3D成像技术，同样源于经典相衬技术体系。起因是Yoshimasa Suzuki等认为，无论是经典相衬观察技术，还是尼康公司开发的APC方法，不能从根本上消除图像中的光晕。故摒弃传统的光波相位-振幅调制法而另辟蹊径，用“相位-光通量调制”方法开发出专用于厚组织样品3D成像技术。这一技术方法的特点是保留了经典相衬体系中的透射光环形光阑而去除物镜相位板。其理论基础是光的折射原理。利用透射光经折射后光传播路径发生偏移的内在规律，针对10x物镜入瞳直径而调整环形光阑大小，利用不同透射光传播方向偏移程度的不同，调制物镜入瞳光量和入瞳角度，将观察对象的折射率、尺寸大小、样品厚度及表面外形倾斜角度等细微差异以图像色泽明暗的形式精确呈现。此观察模式下，类器官、胚胎细胞外形和3D立体构型被塑造得栩栩如生。而在经典相衬技术方法中，透射光折射方向偏移这一事实，是学界和产业界一直忽略的因素。

       实际上，即便APC相位板，技术上也并非至臻至美。不同细胞群大小尺寸不同，ND减光环的宽度设计及光透射率的优化，透射照明光源波长优化，透射光因传播方向偏移造成相位板上窜扰污染问题，都还值得我国业界去探求和解决（感谢许锐伟帮助提供资料）。

参考文献

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