传统倒置相差显微镜在细胞图像采集中的运用与技术局限-下篇

 （前续：一、相差显微技术的基本构成要素） 

3、环形光阑-相位板共轭

       从相衬干涉光路图看，环形光阑处于聚光镜的前焦点平面上。若圆环状照明光束平行穿越环形光阑，被聚光镜组汇聚成小光斑投射到样品平面（聚光镜后焦平面）。从薄而透明的样品层透射后，大部分光以入射前的传播方向前行并被物镜收集和重新聚焦于物镜像平面。
       两束照明光源在样品平面交叉呈现为对称的X型。环形光阑光环的直径、宽度决定着4条X型光臂间的夹角大小和光束的粗细。同一个光阑在与不同数值孔径的物镜组合时，物镜聚光性能差别，使得物镜后方光路前行角度、直射参考光在相位板上投射角度、位置和面积均产生变化。这就要求物镜相位板安装位置、盘面通光面积大小、共轭区与补偿区直径大小、位置及宽度都要相应调整，以确保直射参考光、样品衍射光能各行其道，从相位板设定区域穿过，以减少三个分区间杂散光窜扰。因此。特定环状光阑与具有相应相位板的物镜组合，两种透射光的光路复合后才能产生明暗对比效果理想的相差图像。
       业内采用PHL、PH1、PH2、PH3、PH4的方法标示环形光阑的技术规格。PH后面的字符或数字代表与之匹配的相差物镜数值孔径（Numerical Aperture, NA）值。通常，PHL物镜NA值≤0.13，PH1物镜NA值≤0.50，PH2物镜NA值为0.55-1.0，而PH3、PH4物镜属于NA大于1.0的60X、100X倍率的油镜。
       环形光阑的环带宽度、直径随着PH数字增加而加大，而相位板通光区（共轭区+补偿区）直径和宽度则随PH数字增加而缩小。一旦调整相位板在光路中所处位置，则板的总通光面积、共轭环及补偿区大小、比例均需相应重新调整优化，以实现衍射光与直射参考光线的分离与调制效果最优化。而这将意味着物镜相衬规格的变化。各品牌厂商的20X相差物镜通常有20X PH1和20X PH2之分，其内涵及道理就在于此。

二、倒置相差显微镜相衬元件的运用方法和新趋势

       无论仪器配置、操作使用，都应遵从光阑、物镜相位板规格匹配原则。如PH1光阑，只能与带PH1标识物镜配套使用。

       蔡司、徕卡及Olympus等厂商已在常规40X PH2相差物镜基础上开发出新的40X PH1物镜。如此一来，10x、20x和40x三个物镜可以共享相同的环形光阑。如要在10x、20x、40x倍率物镜间切换时，无需移动相衬滑块和环形光阑对中调整，可依旧维持相差观察效果。因此，活细胞相差图像采集操作，蔡司Primovert、Leica DMi1、Olympus CKX53等基础型倒置相差显微镜，甚至比Leica DM IL LED、Axiovert 5 TL FL SCB、Olympus IXplore Standard（IX73）等功能复杂的手动显微成像系统简便。

       以蔡司Primovert倒置相差显微镜为例，NA 0.4聚光镜相差滑块具有PH0、PH1和PH2三个相衬光阑孔位。将PH1光阑置于光路时，Plan-Achromat 10x/0.25 PH1、LD Plan-Achromat 20x/0.3 PH1、LD Plan-Achromat 40x/0.5 PH1三个物镜皆可与之有效匹配，无需重新调整滑板的位置。

       Leica DMi1倒置显微镜也采用了类似相衬系统设计。其S40/0.45聚光镜配置有BF、PH0、PH1和PH2四孔位的相衬滑板，HI PLAN I 10x/0.22 PH1、HI PLAN I 20x/0.30 PH1和HI PLAN I 40x/0.50 PH1三个物镜具有相同相环。在相差观察模式下调整放大倍率时，只需旋转物镜转换盘切换10x—20x—40x镜头时，无需频繁变换滑块相衬光阑。

       相衬光阑与物镜相位板的严格配套要求，这一点在进行显微镜系统配置方案制定时应格外注意。

       以Axiovert 5倒置显微镜相差应用套装为例，聚光镜相衬滑板（Light Ring Slider 或 Phase Contrast Slider，即环形光阑在聚光镜上固定安装用的可插拔式多孔位条板）LD 0.4 slider标配有PH 1环形光阑，故所配置的三个物镜（LD A-Plan 5x/0.15 Ph1、LD A-Plan 10x/0.25 Ph1和LD A-Plan 20x/0.35 Ph1）均为PH1相衬相衬。若使用40x倍率相差物镜，则可选LD Plan-Achromat 40x/0.5 PH1。滑板空位足够情况下，还可增配PH2这类NA值更大、分辨率和灵敏度更高的荧光半复消色差或复消色差物镜。同理，考虑到常用4x物镜筛选视野的操作习惯，选取Plan-Achromat 4x/0.1 PH0物镜时，需同时增配一PH0光阑。 

       常规手动倒置荧光显微镜中，Olympus CKX53略微特殊。它采用的是集成相差（integrated Phase Contrast, iPC）系统设计。iPC系统由预对中相衬滑板CKX3-SLP和一组四个相衬物镜套件（UPLFLN4XIPC NA 0.13/WD 16.4mm、CACHN10XIPC NA 0.25/ WD 8.8mm、LCACHN20XIPC NA 0.4/ WD 3.2mm和LCACHN40XIPC NA 0.55/ WD 2.2mm）组成。相衬滑板CKX3-SLP三个孔位的正中位置安装有iPH环形光阑，全部4X-40X四个相差物镜通用。调整图像放大倍率时无需对相差滑板的环形光阑做任何调整，并可确保四个相差物镜下视野图像高对比度和细节高清晰度最佳，操作极简便。

       Zeiss Axio Observer 7、Leica DMi8、Olympus IXplore Pro等电动控制型高级倒置荧光显微镜配备有7-8位电动聚光镜转盘，一般可安装多达4-5个环形光阑，对相差类型物镜的选择上具有更大灵活性。此外，得益于无线远光学系统设计，高级研究级倒置显微镜的光路节点和接口更多，不仅可物镜后光路上进行新型内置相差对比法（intermediate phase contrast, IPH)，还可引入微分干涉对比(differential interference contrast, DIC)、霍夫曼调制对比(Hoffman Modualtion Contrast, HMC)、集成调制对比度（intermediate modulation contrast, IMC）调制选项，支持多模式的透射光成像。 

三、经典相衬观察法的技术局限性 

       二战结束后，倒置相差显微镜在生物医学实验中的广泛应用，验证了相衬显微技术发明的巨大科学价值。此后，业界在此基础上，引入了透射光滤光片（可参考：《倒置显微镜细胞图像采集中透射滤光片的合理使用》）、水镜和高性能相差物镜，使相差图像的对比度和图像质量提升到新的高度。
        理想情况下，相差图像代表的是样品中微观结构的折射率和厚度的差异。但遗憾的是，相差图像中普遍存在两种伪影（artifacts）效应——光晕和阴影。
       相位光晕（Phase Halo），即细胞等相位体的外缘出现的伪影条带，是一个强度与样品相反的围绕着样品和亚细胞结构的漫反射光环。当目标相位体比周围介质暗时，深色的观察目标将在浅背景上出现明亮光晕。而当观察目标比周围介质亮时，浅色目标将在较暗背景上出现深色光晕。
       阴影效果（Shading off effect）是指在相位体内部呈现的复杂明暗区域图案现象。如观察目标为深色，则其中央（如细胞核区域）会出现一明亮环。反之，如目标对象为浅色，则其内部会出现一个中央暗区。

        传统相差显微镜采集图像存在伪影效应问题，给光晕掩饰区域图像的真实轮廓和边界的识别分析带来很大困难。
        一般认为，伪影的出现属于相衬观察技术固有缺陷所致。一个常见的解释是，伪影的产生与衍射光、直射管跨区窜扰有关：少量的部分样品衍射光经过相位板共轭环区，其相位发生了延迟（或提前）。而同时，还有一部分直射光从相位板补偿区透射。由于两种光线窜扰技术上在所难免，其叠加到“正常”相干图像上的综合结果造成了伪影。
        有业界人士对伪影产生原因有不同理解。其依据是：对iPS 细胞观察中发现，当物镜焦点变化时，观察到图像中的亮带从iPS 细胞的外部移动到细胞内部。而这一现象与晶体矿物光学实验中贝克线（Becke line）的光学特征完全相符。贝克线是指晶体光学实验中，在两种折射率不同的透明晶体交界处观察到明亮光晕及相对灰暗的条带。当物镜焦点远离样品时，亮线向折射率较高的一侧晶体移动，当焦点与样品拉进时，亮线向折射率较低的介质一侧移动。光晕与阴影是细胞与周围介质的折射率存在差别时发生的必然现象。
        此外，相衬显微成像技术在两个方面应用还存在受到限制。
        1） 相差非常适合样品厚度为5μm以内的薄、无色、透明标本的观察。但如果标本非常厚，则会导致相位改变结构叠加后样品的上层清晰而深层则模糊不清的情形以及样品外缘光晕干扰。相差图像对iPSC细胞、类器官等厚样品缺少立体层次表现力。
       2 ） 相位板一定程度上损害了物镜分辨率。尽管相位物镜非常适合明场工作。但相位环安装于物镜出瞳侧，其共轭区会阻挡部分光线输出，而透射光相位偏移还会引起的轻微干涉图案。因此，相位板的存在使物镜对高分辨率、高灵敏度、微弱荧光采集能力下降，造成图像分辨率损害。
        相衬观察法不仅是应用上存在局限性，在理论上也有待完善。如在对相衬显微成像原理、图像光晕现象解释和解决办法上，业界和学界目前还缺少明确而统一的意见。与相衬显微有关文献还基本处于在技术原理数理论证层面，缺乏更深入探讨和论证。调研中发现，大量公开图片、资料对相差显微成像机制的理解、描述上存在不准确甚至谬误之处。

        理论创新和探索基础的薄弱，制约了业界对倒置相差显微成像技术的改进提升空间。

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